Les méthodes décrites ici décrivent une procédure utilisée pour inverser optogénétiquement la plasticité induite par la cocaïne dans un circuit comportementalement pertinent chez le rat. La stimulation optique soutenue à basse fréquence des synapses thalamo-amygdales induit une dépression à long terme (LTD). La DLT optogénétique in vivo induite chez des rats ayant consommé de la cocaïne a entraîné une atténuation subséquente de la recherche de drogue motivée par des signaux.
Ce protocole démontre les étapes nécessaires à l’utilisation d’outils optogénétiques pour inverser la plasticité induite par la cocaïne dans les circuits thalamo-amygdale afin de réduire les comportements ultérieurs de recherche de cocaïne chez le rat. Dans nos recherches, nous avions constaté que lorsque des rats s’auto-administrent de la cocaïne par voie intraveineuse associée à un signal audiovisuel, les synapses formées aux entrées du noyau géniculé médian du thalamus (MGN) sur les principaux neurones de l’amygdale latérale (LA) deviennent plus fortes à mesure que l’association signale-cocaïne est apprise. Nous avons émis l’hypothèse que l’inversion de la plasticité induite par la cocaïne au niveau de ces synapses réduirait le comportement de recherche de cocaïne motivé par les signaux. Afin d’accomplir ce type de neuromodulation in vivo, nous voulions induire une dépression synaptique à long terme (LTD), qui diminue la force des synapses MGN-LA. À cette fin, nous avons utilisé l’optogénétique, qui permet la neuromodulation des circuits cérébraux à l’aide de la lumière. L’opsine excitatrice oChiEF a été exprimée sur des terminaux MGN présynaptiques dans l’AL en infusant un AAV contenant oChiEF dans le MGN. Des fibres optiques ont ensuite été implantées dans le LA et une lumière laser de 473 nm a été pulsée à une fréquence de 1 Hz pendant 15 minutes pour induire la LTD et inverser la plasticité induite par la cocaïne. Cette manipulation produit une réduction durable de la capacité des signaux associés à la cocaïne à induire des actions de recherche de drogue.
La toxicomanie est un problème de santé publique très grave aux États-Unis et dans le monde. Malgré des décennies de recherches intenses, il existe très peu d’options thérapeutiques efficaces 1,2. Un revers majeur du traitement est le fait que la consommation chronique de drogues génère des souvenirs associatifs à long terme entre les signaux environnementaux et la drogue elle-même. La réexposition à des signaux liés à la drogue entraîne des réponses physiologiques et comportementales qui motivent la consommation continue de drogues et la rechute3. Une nouvelle stratégie thérapeutique consiste à mettre en œuvre des traitements basés sur la mémoire qui visent à manipuler les circuits impliqués dans la régulation des associations médicament-signal. Récemment, il a été observé que les synapses de l’amygdale latérale (LA), en particulier celles provenant du noyau géniculé médian (MGN) du thalamus, sont renforcées par l’auto-administration répétée de cocaïne associée à des signaux, et que cette potentialisation peut soutenir le comportement de recherche de cocaïne 4,5. Par conséquent, il a été proposé que la réintégration induite par les signaux puisse être atténuée en inversant la plasticité au niveau des synapses MGN-LA.
La capacité de cibler précisément la plasticité synaptique d’un circuit cérébral spécifique a été un défi majeur pour le domaine. Les outils pharmacologiques traditionnels ont eu un certain succès dans la diminution des comportements de rechute, mais sont limités par l’incapacité de manipuler les synapses individuelles. Cependant, le développement récent de l’optogénétique in vivo a fourni les outils nécessaires pour surmonter ces limitations et contrôler les voies neuronales avec une précision temporelle et spatiale 6,7,8. En exprimant des opsines sensibles à la lumière dans un circuit cérébral spécifique, la lumière laser peut ensuite être utilisée pour activer ou inhiber le circuit. La stimulation optique dépendante de la fréquence peut être utilisée pour manipuler spécifiquement la plasticité synaptique du circuit chez un animal au comportement.
Ce manuscrit décrit la procédure suivie pour manipuler le circuit MGN-LA pertinent sur le plan comportemental en utilisant l’optogénétique in vivo . Tout d’abord, l’opsine excitatrice oChIEF a été exprimée dans le MGN et des fibres optiques ont été implantées bilatéralement dans le LA. Les animaux ont ensuite été entraînés à s’auto-administrer de la cocaïne d’une manière dépendante des signaux, ce qui potentialise la voie MGN-LA. Ensuite, une stimulation soutenue à basse fréquence avec une lumière laser de 473 nm a été utilisée pour produire une LTD spécifique au circuit. L’inversion de la plasticité induite par la consommation de cocaïne a généré une réduction durable de la capacité des signaux à déclencher des actions associées au comportement de recherche de drogue.
Comme décrit ci-dessus, plusieurs étapes critiques sont importantes pour obtenir les résultats expérimentaux appropriés. Le protocole ne sera probablement efficace que chez les animaux qui acquièrent correctement l’auto-administration de cocaïne et, à ce jour, il n’a été testé qu’à l’aide des paramètres décrits ci-dessus. Il est possible que la dose de cocaïne, le calendrier de renforcement et les paramètres de signal puissent être modifiés avec probablement peu d’effet sur les résultats comp…
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs souhaitent remercier les subventions de l’USPHS K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) et le ministère de la Santé de Pennsylvanie.
0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
Betadine | Butler Schein | 38250 | |
Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
Cryostat | Leica | CM1950 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
Heparin | Henry Schein | 55737 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
Vibratome | Leica | VT1200S | |
Xylazine | Butler Schein | 33198 |