Summary

Sıçanlarda Nöroplastisiteyi Tersine Çevirmek ve Kokain Arayışını Engellemek için Optogenetiği Kullanmak

Published: October 05, 2021
doi:

Summary

Burada açıklanan yöntemler, sıçanlarda davranışsal olarak ilgili bir devrede kokain kaynaklı plastisiteyi optogenetik olarak tersine çevirmek için kullanılan bir prosedürü özetlemektedir. Talamo-amigdala sinapslarının sürekli düşük frekanslı optik stimülasyonu uzun süreli depresyona (LTD) neden olur. Kokain deneyimli sıçanlarda in vivo optogenetik olarak indüklenen LTD, ipucu güdümlü uyuşturucu arayışının daha sonra zayıflamasına neden oldu.

Abstract

Bu protokol, sıçanda sonraki kokain arama davranışlarını azaltmak için talamo-amigdala devrelerinde kokain kaynaklı plastisiteyi tersine çevirmek için optogenetik araçları kullanmak için gereken adımları göstermektedir. Araştırmamızda, sıçanlar görsel-işitsel bir ipucu ile eşleştirilmiş intravenöz kokaini kendi kendine uyguladıklarında, talamusun (MGN) medial genikülat çekirdeğinden lateral amigdala’nın (LA) ana nöronlarına yapılan girdilerde oluşan sinapsların, ipucu-kokain ilişkisi öğrenildikçe güçlendiğini bulmuştuk. Bu sinapslarda kokain kaynaklı plastisitenin tersine çevrilmesinin, ipucu motivasyonlu kokain arama davranışını azaltacağını varsaydık. Bu tip nöromodülasyonu in vivo olarak gerçekleştirmek için, MGN-LA sinapslarının gücünü azaltan sinaptik uzun süreli depresyonu (LTD) indüklemek istedik. Bu amaçla, ışık kullanarak beyin devrelerinin nöromodülasyonuna izin veren optogenetiği kullandık. Uyarıcı opsin oChiEF, LA’daki presinaptik MGN terminallerinde, MGN’ye oChiEF içeren bir AAV infüze edilerek eksprese edildi. Optik fiberler daha sonra LA’ya implante edildi ve 473 nm lazer ışığı, LTD’yi indüklemek ve kokain kaynaklı plastisiteyi tersine çevirmek için 15 dakika boyunca 1 Hz frekansında darbelendi. Bu manipülasyon, kokain ile ilişkili ipuçlarının uyuşturucu arama eylemlerini tetikleme yeteneğinde uzun süreli bir azalma sağlar.

Introduction

Madde bağımlılığı, ABD’de ve dünya çapında çok ciddi bir halk sağlığı sorunudur. Onlarca yıllık yoğun araştırmalara rağmen, çok az sayıda etkili terapötik seçenek vardır 1,2. Tedavideki önemli bir gerileme, kronik uyuşturucu kullanımının çevresel ipuçları ile ilacın kendisi arasında uzun süreli ilişkisel anılar oluşturmasıdır. İlaçla ilgili ipuçlarına yeniden maruz kalmak, devam eden uyuşturucu kullanımını ve nüksetmeyi motive eden fizyolojik ve davranışsal tepkileri yönlendirir3. Yeni bir terapötik strateji, ilaç-ipucu ilişkilerinin düzenlenmesinde yer alan devreleri manipüle etmeyi amaçlayan hafıza tabanlı tedavileri yürürlüğe koymaktır. Son zamanlarda, lateral amigdaladaki (LA) sinapsların, özellikle talamusun medial genikülat çekirdeğinden (MGN) kaynaklananların, tekrarlanan ipucu ile ilişkili kokain kendi kendine yönetimi ile güçlendirildiği ve bu potansiyelin kokain arama davranışını destekleyebileceği gözlenmiştir 4,5. Bu nedenle, MGN-LA sinapslarında plastisiteyi tersine çevirerek ipucu kaynaklı eski haline getirmenin zayıflatılabileceği önerilmiştir.

Belirli bir beyin devresinin sinaptik plastisitesini tam olarak hedefleme yeteneği, alan için büyük bir zorluk olmuştur. Geleneksel farmakolojik araçlar, nüks davranışlarını azaltmada bazı başarılara sahiptir, ancak bireysel sinapsları manipüle edememe ile sınırlıdır. Bununla birlikte, in vivo optogenetiğin son zamanlardaki gelişimi, bu sınırlamaların üstesinden gelmek ve nöral yolları zamansal ve mekansal hassasiyetle kontrol etmek için gereken araçları sağlamıştır 6,7,8. Belirli bir beyin devresinde ışığa duyarlı opsinleri ifade ederek, lazer ışığı daha sonra devreyi aktive etmek veya inhibe etmek için kullanılabilir. Frekansa bağlı optik stimülasyon, davranan bir hayvanda devrenin sinaptik plastisitesini spesifik olarak manipüle etmek için kullanılabilir.

Bu makale, in vivo optogenetik kullanarak davranışsal olarak ilgili MGN-LA devresini manipüle etmek için alınan prosedürü özetlemektedir. İlk olarak, uyarıcı opsin oChIEF MGN’de eksprese edildi ve optik fiberler LA’ya iki taraflı olarak implante edildi. Hayvanlar daha sonra MGN-LA yolunu güçlendiren ipucuna bağımlı bir şekilde kokaini kendi kendine yönetmek için eğitildi. Daha sonra, 473 nm lazer ışığı ile sürekli, düşük frekanslı stimülasyon, devreye özgü LTD üretmek için kullanıldı. kokain kullanımının neden olduğu plastisiteyi tersine çevirmek, uyuşturucu arama davranışı ile ilişkili eylemleri tetiklemek için ipuçlarının kapasitesinde uzun süreli bir azalma yarattı.

Protocol

Bu protokolde açıklanan deneyler, Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu tarafından ortaya konan kılavuzlarla tutarlıydı ve Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Tüm prosedürler, varışta 275-325 g ağırlığındaki yetişkin, naif Sprague-Dawley sıçanları kullanılarak gerçekleştirildi. 1. Optik Fiber İmplantların ve Patch Kabloların Yapımı</strong…

Representative Results

Deneylerin sırasını özetleyen bir zaman çizelgesi Şekil 1’de gösterilmiştir. Davranışsal deneyler boyunca, kokain infüzyonlarının sayısı ve aktif kolda verilen tepkilerin sayısı, kokain arama davranışının yoğunluğunun bir ölçüsü olarak hizmet eder. Kokainin kendi kendini yönetmesinin ilk günlerinde, ikinci hafta boyunca istikrara kavuşmadan önce, aktif yanıtların sayısı her edinim günü boyunca kademeli olarak artmalıdır. Tersine, inaktif kol yanıtları…

Discussion

Yukarıda açıklandığı gibi, uygun deneysel sonuçlara ulaşmak için önemli olan birkaç kritik adım vardır. Protokol muhtemelen yalnızca kokainin kendi kendini yönetmesini uygun şekilde elde eden hayvanlarda etkili olacaktır ve bugüne kadar yalnızca yukarıda belirtilen parametreler kullanılarak test edilmiştir. Kokain dozu, takviye programı ve işaret parametrelerinin, davranışsal sonuçlar üzerinde muhtemelen çok az etkisi olacak şekilde değiştirilmesi mümkündür, ancak ikinci dereceden bir t…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, USPHS’nin K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) ve Pennsylvania Sağlık Bakanlığı’nın desteğini kabul etmek istiyor.

Materials

0.9% Saline Fisher Scientific NC0291799
A.M.P.I. Stimulus Isolator Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) #268 See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Control) Duke Viral Vector Core Control See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
Artificial Tears (Opthalmic Ointment) Covetrus 70349
ATP Magnesium Salt Fisher Scientific A9187
Betadine Butler Schein 38250
Calcium chloride Fisher Scientific C1016
Cesium chloride Fisher Scientific 289329
Cesium hydroxide Fisher Scientific 516988
Cesium methanesulfonate Fisher Scientific C1426
Cocaine HCl NIDA Drug Supply Center 9041-001
Cryostat Leica CM1950
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270
DMSO Fisher Scientific BP231-1
Dual-Channel Temperature Controller Warner Instruments TC-344C
EGTA Fisher Scientific E3889
Ethanol University of Pittsburgh Chemistry Stockroom 200C5000
Ferrule Dust Caps Thor Labs CAPL White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules
Ferrule Mating Sleeves Doric Lenses F210-3011 Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID
Ferrules Precision Fiber Products MM-FER2007C-2300 Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size
Fiber Optic Thor Labs FP200URT 200 μm core multimode fiber (0.5 NA)
Fiber Optic Rotary Joint Prizmatix (Ordered from Amazon) 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber
Fiber Stripping Tool Thor Labs T12S21
Fluoroshield with DAPI Sigma-Aldrich F6057
Gentamicin Henry Schein 6913
GTP Sodium Salt Fisher Scientific G8877
Hamilton syringe Hamilton 80085 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3
Heat Gun Allied Electronics 972-6966 250 V, 750-800 °F
Heat-Curable Epoxy Precision Fiber Products PFP-353ND-8OZ
Heparin Henry Schein 55737
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hydrochloric Acid Fisher Scientific 219405490
Isoflurane Henry Schein 29405
Ketamine HCl Henry Schein 55853 Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines
Lactated Ringer’s Henry Schein 9846
Laser, driver, and laser-to-fiber coupler OEM Laser Systems BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option)
L-glutathione Fisher Scientific G4251
Lidocaine Butler Schein 14583
Light Sensor Thor Labs PM100D Compact energy meter console with digital display
Loctite instant adhesive Grainger 5E207
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich 203726
Microelectrode Amplifier/Data Acquisition Molecular Devices MULTICLAMP700B / Digidata 1440A
Microinjector pump Harvard Apparatus 70-4501 Dual syringe
Micromanipulator Sutter Instruments MPC-200/ROE-200
Microscope Olympus BX51WI Upright microscope for electrophysiology
Microscope Olympus BX61VS Epifluorescent slide-scanning microscope
N-methyl-D-glucamine Sigma-Aldrich M2004
Orthojet dental cement, liquid Lang Dental 1504BLK black
Orthojet dental cement, powder Lang Dental 1530BLK Contemporary powder, black
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Patch Cables Thor Labs FP200ERT Multimode, FT030 Tubing
Picrotoxin Fisher Scientific AC131210010
Polishing Disc Thor Labs D50FC
Polishing Pad Thor Labs NRS913 9" x 13"
Polishing Paper Thor Labs LFG5P 5 μm grit
Polishing Paper Thor Labs LFG3P 3 μm grit
Polishing Paper Thor Labs LFG1P 1 μm grit
Polishing Paper Thor Labs LFG03P 0.3 μm grit
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
Potassium hydroxide Fisher Scientific P5958
Potassium methanesulfonate Fisher Scientific 83000
QX-314-Cl Alomone Labs Q-150
Rimadyl (Carprofen) Henry Schein 24751
Self-Administration Chambers/Software Med Associates MED-NP5L-D1
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S5761
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich 1064980500
Sodium L-Ascorbate Sigma-Aldrich A7631
Sodium Pentobarbital Henry Schein 24352
Sodium phosphate Sigma-Aldrich S9638
Sodium phosphocreatine Fisher Scientific P7936
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256
Stainless steel machine screws WW Grainger  6GB25 M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length
Stereotaxic adapter for ferrules Thor Labs XCL
Stereotaxic Frame Stoelting 51603
Sucrose Sigma-Aldrich S8501
Suture Thread Fine Science Tools 18020-50 Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm
TEA-Chloride Fisher Scientific T2265
Thiourea Sigma-Aldrich T8656
Vetbond Tissue Adhesive Covetrus 001505
Vibratome Leica VT1200S
Xylazine Butler Schein 33198

References

  1. Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
  2. Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T. Role of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS) in treatment of addiction and related disorders: A systematic review. Current Drug Abuse Reviews. 10 (1), 31-43 (2017).
  3. Shaham, Y., Shalev, U., Lu, L., De Wit, H., Stewart, J. The reinstatement model of drug relapse: History, methodology and major findings. Psychopharmacology. 168 (1-2), 3-20 (2003).
  4. Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Plasticity at Thalamo-amygdala Synapses Regulates Cocaine-Cue Memory Formation and Extinction. Cell Reports. 26 (4), 1010-1020 (2019).
  5. Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Calcineurin promotes neuroplastic changes in the amygdala associated with weakened cocaine-cue memories. Journal of Neuroscience. 40 (6), 1344-1354 (2020).
  6. Deisseroth, K. Optogenetics 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  7. Gradinaru, V., et al. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141 (1), 154-165 (2010).
  8. Nabavi, S., Fox, R., Proulx, C. D., Lin, J. Y., Tsien, R. Y., Malinow, R. Engineering a memory with LTD and LTP. Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).
  9. Sparta, D. R., Stamatakis, A. M., Phillips, J. L., Hovelsø, N., Van Zessen, R., Stuber, G. D. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7 (1), 12-23 (2012).
  10. Stripling, J. S. A simple intravenous catheter for use with a cranial pedestal in the rat. Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 15 (5), 823-825 (1981).
  11. Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophysical Journal. 96 (5), 1803-1814 (2009).
  12. Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates Hard Cover Edition. , 466 (2013).
  13. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: Application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).
  14. Bender, B. N., Torregrossa, M. M. Dorsolateral striatum dopamine-dependent cocaine seeking is resistant to pavlovian cue extinction in male and female rats. Neuropharmacology. 182, (2021).
  15. Milton, A. L., Everitt, B. J. The persistence of maladaptive memory: Addiction, drug memories and anti-relapse treatments. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 36 (4), 1119-1139 (2012).
  16. Torregrossa, M. M., Taylor, J. R. Learning to forget: Manipulating extinction and reconsolidation processes to treat addiction. Psychopharmacology. 226 (4), 659-672 (2013).
  17. Kalivas, P. W., Volkow, N. D. The Neural Basis of Addiciton: A Pathology of Motivation and Choice. American Journal of Psychiatry. 162 (8), 1403-1413 (2005).
  18. Stefanik, M. T., et al. Optogenetic inhibition of cocaine seeking in rats. Addiction Biology. 18 (1), 50-53 (2013).
  19. Arguello, A. A., et al. Role of a Lateral Orbital Frontal Cortex-Basolateral Amygdala Circuit in Cue-Induced Cocaine-Seeking Behavior. Neuropsychopharmacology. 42 (3), 727-735 (2017).
  20. Cruz, A. M., Spencer, H. F., Kim, T. H., Jhou, T. C., Smith, R. J. Prelimbic cortical projections to rostromedial tegmental nucleus play a suppressive role in cue-induced reinstatement of cocaine seeking. Neuropsychopharmacology. 46 (8), 1399-1406 (2021).
  21. Cruz, F. C., Javier Rubio, F., Hope, B. T. Using c-fos to study neuronal ensembles in corticostriatal circuitry of addiction. Brain Research. 1628, 157-173 (2015).
  22. Rubio, F. J., et al. Context-Induced Reinstatement of Methamphetamine Seeking Is Associated with Unique Molecular Alterations in Fos-Expressing Dorsolateral Striatum Neurons. Journal of Neuroscience. 35 (14), 5625-5639 (2015).
  23. Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. 86 (4), 923-935 (2015).
  24. McCracken, C. B., Grace, A. A. High-frequency deep brain stimulation of the nucleus accumbens region suppresses neuronal activity and selectively modulates afferent drive in rat orbitofrontal cortex in vivo. Journal of Neuroscience. 27 (46), 12601-12610 (2007).
  25. Zhang, H., Bramham, C. R. Bidirectional Dysregulation of AMPA Receptor-Mediated Synaptic Transmission and Plasticity in Brain Disorders. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12 (26), (2020).

Play Video

Cite This Article
Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Using Optogenetics to Reverse Neuroplasticity and Inhibit Cocaine Seeking in Rats. J. Vis. Exp. (176), e63185, doi:10.3791/63185 (2021).

View Video