광유전학을 사용하여 신경 가소성을 역전시키고 쥐에서 코카인 추구를 억제
Summary
여기에 설명 된 방법은 쥐의 행동 관련 회로에서 코카인으로 유도 된 가소성을 광학 유전 학적으로 역전시키는 데 사용되는 절차를 설명합니다. 시상 편도체 시냅스의 지속적인 저주파 광 자극은 장기 우울증 (LTD)을 유도합니다. 코카인 경험이 있는 쥐에서 생체내 광유전학적으로 유도된 LTD는 단서-동기 약물 탐색의 후속 감쇠를 초래하였다.
Abstract
이 프로토콜은 광유전학적 도구를 사용하여 시상-편도체 회로에서 코카인 유발 가소성을 역전시켜 쥐의 후속 코카인 탐색 행동을 줄이는 데 필요한 단계를 보여줍니다. 우리의 연구에서, 우리는 쥐가 시청각 신호와 쌍을 이루는 정맥 내 코카인을자가 투여 할 때, 시상 (MGN)의 내측 생식기 핵에서 측면 편도체 (LA)의 주요 뉴런으로의 입력에서 형성된 시냅스가 큐 – 코카인 연관성이 학습됨에 따라 더 강해진다는 것을 발견했습니다. 우리는이 시냅스에서 코카인으로 유도 된 가소성의 역전이 단서 동기 부여 코카인 추구 행동을 감소시킬 것이라고 가정했다. 생체 내에서 이러한 유형의 신경 조절을 달성하기 위해 MGN-LA 시냅스의 강도를 감소시키는 시냅스 장기 우울증 (LTD)을 유도하고자했습니다. 이를 위해 우리는 빛을 사용하여 뇌 회로의 신경 조절을 허용하는 광유전학을 사용했습니다. 흥분성 옵신 oChiEF는 oChiEF를 포함하는 AAV를 MGN에 주입하여 LA의 시냅스 전 MGN 말단에서 발현되었습니다. 그런 다음 광섬유를 LA에 이식하고 473nm 레이저 광을 1Hz의 주파수에서 15분 동안 펄스하여 LTD 및 역 코카인 유도 가소성을 유도했습니다. 이 조작은 마약 추구 행동을 유도하는 코카인과 관련된 단서의 능력을 오래 지속적으로 감소시킵니다.
Introduction
약물 남용은 미국과 전 세계적으로 매우 심각한 공중 보건 문제입니다. 수십 년간의 집중적인 연구에도 불구하고 효과적인 치료 옵션은 거의 없습니다 1,2. 치료의 주요 차질은 만성 약물 사용이 환경 단서와 약물 자체 사이에 장기적인 연관 기억을 생성한다는 사실입니다. 약물 관련 단서에 다시 노출되면 지속적인 약물 사용과 재발을 유발하는 생리적 및 행동적 반응을유도합니다3. 새로운 치료 전략은 약물 큐 연관성을 조절하는 데 관련된 회로를 조작하는 것을 목표로하는 기억 기반 치료법을 제정하는 것입니다. 최근에, 측면 편도체 (LA)의 시냅스, 특히 시상의 내측 생식기 핵 (MGN)에서 발생하는 시냅스는 반복적 인 큐 관련 코카인자가 투여에 의해 강화되며,이 강화는 코카인 추구 행동 4,5를 지원할 수 있음이 관찰되었습니다. 따라서 MGN-LA 시냅스에서 가소성을 역전시킴으로써 큐 유도 복원이 감쇠 될 수 있다고 제안되었습니다.
특정 뇌 회로의 시냅스 가소성을 정확하게 표적화하는 능력은 이 분야의 주요 과제였습니다. 전통적인 약리학 적 도구는 재발 행동을 줄이는 데 어느 정도 성공했지만 개별 시냅스를 조작 할 수 없기 때문에 제한적입니다. 그러나 최근 생체 내 광유전학의 개발은 이러한 한계를 극복하고 시간적 및 공간적 정밀도로 신경 경로를 제어하는 데 필요한 도구를 제공했습니다6,7,8. 특정 뇌 회로에서 빛에 민감한 옵신을 표현함으로써 레이저 광을 사용하여 회로를 활성화하거나 억제 할 수 있습니다. 주파수 의존적 광 자극은 행동하는 동물에서 회로의 시냅스 가소성을 구체적으로 조작하는 데 활용 될 수 있습니다.
이 원고는 생체 내 광유전학을 사용하여 행동적으로 관련된 MGN-LA 회로를 조작하기 위해 취한 절차를 간략하게 설명합니다. 먼저, 흥분성 옵신 oChIEF를 MGN에서 발현시키고 광섬유를 LA에 양측으로 이식하였다. 그런 다음 동물들은 MGN-LA 경로를 강화하는 큐 의존적 방식으로 코카인을자가 투여하도록 훈련 받았습니다. 다음으로, 473nm 레이저 광을 사용한 지속적인 저주파 자극을 사용하여 회로 별 LTD를 생성했습니다. 코카인 사용으로 유도 된 가소성을 역전시키는 것은 마약 추구 행동과 관련된 행동을 유발하는 단서의 능력을 오래 지속시키는 감소를 일으켰습니다.
Protocol
이 프로토콜에 설명 된 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 국립 보건원 가이드에서 정한 지침과 일치하며 피츠버그 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 모든 절차는 도착시 무게가 275-325g 인 성인의 순진한 Sprague-Dawley 쥐를 사용하여 수행되었습니다. 1. 광섬유 임플란트 및 패치 케이블의 건설 이전에 발표 된 프로토?…
Representative Results
실험 순서를 요약한 타임라인이 그림 1에 나와 있습니다. 행동 실험 전반에 걸쳐 코카인 주입 횟수와 활성 레버에 대한 반응 수는 코카인 추구 행동의 강도를 측정하는 역할을합니다. 코카인자가 투여의 초기 일 동안, 활성 반응의 수는 두 번째 주 동안 안정화되기 전에 각 획득 일에 걸쳐 점차적으로 증가해야합니다. 반대로, 비활성 레버 반응은 실험 전체에서 낮게 유지되?…
Discussion
위에서 설명한 것처럼 적절한 실험 결과를 얻는 데 중요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 이 프로토콜은 코카인자가 투여를 적절하게 획득 한 동물에서만 효과적 일 수 있으며 현재까지는 위에 설명 된 매개 변수를 사용하여 테스트되었습니다. 코카인 복용량, 강화 일정 및 큐 매개 변수는 행동 결과에 거의 영향을 미치지 않고 수정 될 수 있지만, 2 차 강화 일정은 편도체 독립적 인 코카인 탐?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 USPHS 보조금 K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) 및 펜실베니아 보건부의 지원을 인정하고자합니다.
Materials
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | See Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | White plastic dust caps for 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Bronze, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Ceramic ferrule, Ø230 μm hole size |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm core multimode fiber (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Ordered from Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector for fiber |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton syringe | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, point style 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparin | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is a controlled substance and should be handled according to institutional guidelines |
| Lactated Ringer’s | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver, and laser-to-fiber coupler | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-pumped solid-state laser (One option) |
| L-glutathione | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaine | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compact energy meter console with digital display |
| Loctite instant adhesive | Grainger | 5E207 | |
| Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pump | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual syringe |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscope | Olympus | BX51WI | Upright microscope for electrophysiology |
| Microscope | Olympus | BX61VS | Epifluorescent slide-scanning microscope |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet dental cement, liquid | Lang Dental | 1504BLK | black |
| Orthojet dental cement, powder | Lang Dental | 1530BLK | Contemporary powder, black |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Tubing |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Potassium methanesulfonate | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Sodium L-Ascorbate | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | 24352 | |
| Sodium phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| Sodium phosphocreatine | Fisher Scientific | P7936 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Stainless steel machine screws | WW Grainger | 6GB25 | M2-0.40mm Machine Screw, Pan, Phillips, A2 Stainless Steel, Plain, 3 mm Length |
| Stereotaxic adapter for ferrules | Thor Labs | XCL | |
| Stereotaxic Frame | Stoelting | 51603 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Suture Thread | Fine Science Tools | 18020-50 | Silk thread; Size: 5/0, Diameter: 0.12 mm |
| TEA-Chloride | Fisher Scientific | T2265 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Vetbond Tissue Adhesive | Covetrus | 001505 | |
| Vibratome | Leica | VT1200S | |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 |
References
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Cite This Article
Rich, M. T., Huang, Y. H., Torregrossa, M. M. Using Optogenetics to Reverse Neuroplasticity and Inhibit Cocaine Seeking in Rats. J. Vis. Exp. (176), e63185, doi:10.3791/63185 (2021).