Два метода пилинга для выделения компартментов фоторецепторных клеток в сетчатке мыши для анализа белка

Палочковые фоторецепторные клетки, плотно упакованные в самый внешний слой нервной сетчатки, являются неотъемлемой частью зрения тусклого света. Чтобы функционировать как верные счетчики фотонов, палочки используют сигнальный путь на основе G-белка, называемый фототрансдукцией, для генерации быстрых, усиленных и воспроизводимых реакций на захват одного фотона. Эта реакция на свет в конечном итоге вызывает изменение тока на плазматической мембране и впоследствии сигнализируется остальной части зрительной ^{системы1}. Как следует из названия, каждая палочковая клетка имеет отличную палочковидную форму и демонстрирует высокополяризованную клеточную морфологию, состоящую из внешнего сегмента (OS), внутреннего сегмента (IS), тела клетки (CB) и синаптической терминали (ST). Каждый субклеточный компартмент имеет специфический белковый механизм (связанный с мембраной и растворимый), биомолекулярные особенности и белковые комплексы, которые играют решающую роль, такие как визуальная фототрансдукция, общее ведение хозяйства и синтез белка, а также синаптическая ^{передача2,3}.

Более 30 лет назад впервые наблюдалось светозависимое реципрокное движение субклеточных белков, в частности трансдуцина (от ОС) и арестина (к ОС), 4,5,6,7. Вначале это наблюдаемое явление было воспринято скептически, отчасти из-за уязвимости иммуногистохимии к эпитопной маскировке8. В начале 2000-х годов транслокация белка, зависящая от стимула, была подтверждена с помощью строгой и трудной техники физического сечения9. Последовательное тангенциальное сечение замороженной плоской сетчатки грызунов с последующим иммуноблоттингом показало, что трансдуцин9,10, ^{арестин11,12} и ^{восстановление13} подвергаются субклеточному перераспределению в ответ на свет. Считается, что световая транслокация этих ключевых сигнальных белков не только регулирует чувствительность каскада фототрансдукции9,14,15, но также может быть нейропротекторной против повреждения светом16,17,18. Поскольку легкий транспорт белка в палочках, по-видимому, очень важен для биологии и физиологии стержневых клеток, методы, которые позволяют выделять различные субклеточные компартменты для определения распределения белка, являются ценными инструментами исследования.

В настоящее время существует несколько методов, направленных на изоляцию стержневых субклеточных компартментов. Однако эти методы могут быть длительными и трудными для воспроизведения или требуют значительного количества изолята сетчатки. Например, препараты внешнего сегмента стержня (АФК) посредством центрифугирования градиента ^{плотности19} обычно используются для отделения АФК от гомогената сетчатки. Этот метод широко используется для вестерн-блоттинга, но процедура очень трудоемкая и требует минимум 8-12 мышиных ^{сетчаток20}. С другой стороны, последовательное тангенциальное сечение замороженных мышей и сетчатки крыс было успешно реализовано в изоляции OS, IS, CB и ST9,11,13. Однако этот метод является технически сложным из-за необходимости полного сглаживания маленькой и сильно изогнутой мышиной сетчатки для выравнивания слоев сетчатки перед тангенциальным сечением. Поскольку существует множество мышиных моделей и трансгенных мышей, повторяющих заболевания зрительной системы, создание техники, которая надежно, быстро и легко разделяет отдельные стержневые отсеки, имеет перспективы в выявлении физиологических процессов, которые происходят в каждом специализированном отсеке, и механизмов, лежащих в основе зрительных процессов в здоровье и болезни.

Чтобы облегчить эти исследования, мы описываем два метода пилинга, которые изолируют стержневые субклеточные компартменты легче, чем современные протоколы. Первый метод пилинга, адаптированный из метода воздействия флуоресцентно меченых биполярных клеток для записи зажима пластыря21, использует целлюлозную фильтровальную бумагу для последовательного удаления АФК из живой, изолированной мышиной сетчатки (рисунок 1). Второй метод, адаптированный из процедуры, которая изолирует три первичных слоя клеток сетчатки от сетчатки ^chick22 и ^frog23, использует клейкую ленту для удаления внутреннего сегмента АФК и палочки (РИС) из лиофилизированной сетчатки (рисунок 2). Обе процедуры могут быть выполнены за 1 час и значительно удобны для пользователя. Мы обеспечиваем проверку эффективности этих двух протоколов разделения для вестерн-блоттинга путем использования адаптированной к темноте и подверженной воздействию света сетчатки от мышей C57BL / 6J для демонстрации светоиндуцированной транслокации стержневого трансдуцина (GNAT1) и арестина (ARR1). Кроме того, используя метод ленточного пилинга, мы предоставляем дополнительные доказательства того, что наша методика может быть использована для изучения и устранения несоответствий между данными локализации белка, полученными иммуноцитохимией (ICC), и западными пятнами. В частности, наша методика показала, что: 1) изоформа протеинкиназы С-альфа (PKCα) присутствует не только в биполярных клетках, но и в мышиных АФК и РИС, хотя и в низких ^{концентрациях24,25}, и 2) родопсинкиназа (GRK1) присутствует преимущественно в изолированном образце ОС. Эти данные демонстрируют эффективность наших двух методов пилинга для разделения и количественной оценки конкретных стержневых и сетчаточных белков.