Summary

Dois métodos de descascamento para o isolamento de compartimentos celulares fotorreceptor na retina do rato para análise de proteínas

Published: December 07, 2021
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Summary

Este protocolo apresenta duas técnicas para isolar os compartimentos subcelulares de fotorreceptores de haste murina para análise de proteínas. O primeiro método utiliza papel filtro de retina viva e celulose para separar segmentos externos da haste, enquanto o segundo emprega retina liofilizada e fita adesiva para descascar camadas internas e externas do segmento.

Abstract

Os fotorreceptores de rod são neurônios sensoriais altamente polarizados com compartimentos distintos. As hastes do mouse são longas (~80 μm) e finas (~2 μm) e são embaladas lateralmente na camada mais externa da retina, a camada fotorreceptora, resultando no alinhamento de compartimentos subcelulares análogos. Tradicionalmente, a seção tangencial da retina congelada montada plana tem sido usada para estudar o movimento e a localização de proteínas dentro de diferentes compartimentos de vara. No entanto, a alta curvatura da retina do rato dominante da haste torna a seção tangencial desafiadora. Motivados pelo estudo do transporte de proteínas entre compartimentos, desenvolvemos dois métodos de descascamento que isolam de forma confiável o segmento externo da haste (ROS) e outros compartimentos subcelulares para manchas ocidentais. Nossas técnicas relativamente rápidas e simples fornecem frações enriquecidas e subcelulares específicas para medir quantitativamente a distribuição e redistribuição de importantes proteínas fotorreceptoras em hastes normais. Além disso, essas técnicas de isolamento também podem ser facilmente adaptadas para isolar e investigar quantitativamente a composição proteica de outras camadas celulares dentro da retina saudável e degenerada.

Introduction

As células fotorreceptoras de rod, bem embaladas na camada mais externa da retina neural, são parte integrante da visão de luz fraca. Para funcionar como contadores de fótons fiéis, as hastes utilizam uma via de sinalização baseada em proteína G, denominada fototransdução, para gerar respostas rápidas, amplificadas e reprodutíveis à captura de fótons únicos. Esta resposta à luz finalmente desencadeia uma mudança na correnteza na membrana plasmática e é posteriormente sinalizada para o resto do sistema visual1. Como o nome indica, cada célula de haste tem uma forma distinta semelhante a uma haste e exibe uma morfologia celular altamente polarizada, consistindo de um segmento externo (OS), segmento interno (IS), corpo celular (CB) e terminal sináptico (ST). Cada compartimento subcelular possui máquinas proteicas específicas (ligadas à membrana e solúveis), características biomoleculares e complexos proteicos que desempenham papéis cruciais, como fototransdução visual, limpeza geral e síntese de proteínas, e transmissão sináptica2,3.

Há mais de 30 anos, o movimento recíproco dependente da luz de proteínas subcelulares, especificamente transdutina (longe do SO) e preso (em direção ao SO), foi observado pela primeira vez4,5,6,7. No início, esse fenômeno observado foi recebido com ceticismo, devido, em parte, à vulnerabilidade da imunohistoquímica ao mascaramento de epítope8. No início dos anos 2000, a translocação de proteínas dependentes de estímulos foi confirmada por meio de uma rigorosa e árdua técnica de secção física9. A seção tangencial serial da retina de roedores congelados, seguida de imunoblotting, revelou que transducin9,10, prende em 11,12, e recupera em 13 todos passam por redistribuição subcelular em resposta à luz. Acredita-se que a translocação leve dessas proteínas de sinalização chave não só regula a sensibilidade da cascata de fototransdução9,14,15, mas também pode ser neuroprotetora contra danos leves16,17,18. Como o transporte de proteínas leve em hastes parece ser muito significativo para a biologia celular e fisiologia, técnicas que permitem o isolamento de diferentes compartimentos subcelulares para determinar a distribuição de proteínas são ferramentas valiosas de pesquisa.

Atualmente, existem alguns métodos que visam isolar os compartimentos subcelulares da haste. No entanto, esses métodos podem ser longos e difíceis de reproduzir, ou requerem uma quantidade considerável de isolamento da retina. As preparações do segmento externo de rod (ROS) através da centrifugação gradiente de densidade19, por exemplo, é comumente usada para separar o ROS do homogeneato da retina. Este método é amplamente utilizado para a mancha ocidental, mas o procedimento é muito demorado e requer um mínimo de 8-12 retinas murinas20. Por outro lado, a secção tangencial serial da retina congelada de murina e rato foi implementada com sucesso na isolação do SO, IS, CB e ST9,11,13. No entanto, este método é tecnicamente desafiador devido à necessidade de achatar totalmente a pequena e altamente curvada retina murina para alinhar as camadas de retina antes da seção tangencial. Como há uma infinidade de modelos de camundongos e camundongos transgênicos recapitulando doenças do sistema visual, a criação de uma técnica que separa de forma confiável, rápida e fácil os compartimentos individuais de hastes é promissora na revelação dos processos fisiológicos que ocorrem em cada compartimento especializado e dos mecanismos que fundamentam os processos visuais em saúde e doença.

Para facilitar essas investigações, descrevemos dois métodos de descascamento que isolam compartimentos subcelulares de haste mais facilmente do que os protocolos atuais. O primeiro método de peeling, adaptado de uma técnica para expor células bipolares fluorescentes rotuladas para gravação de grampo de remendo21, emprega papel filtro de celulose para remover sequencialmente o ROS de uma retina murina viva e isolada (Figura 1). O segundo método, adaptado de um procedimento que isola as três camadas primárias das células da retina de uma retina de 22 e sapo, utiliza fita adesiva para remover o segmento interno de ROS e haste (RIS) de uma retina liofilizada (Figura 2). Ambos os procedimentos podem ser concluídos em 1h e são consideravelmente fáceis de usar. Fornecemos validação da eficácia desses dois protocolos de separação para a mancha ocidental utilizando retinas adaptadas à escuridão e expostas à luz de camundongos C57BL/6J para demonstrar translocação induzida pela luz de transduína de haste (GNAT1) e arrestin (ARR1). Além disso, usando o método de descascamento de fita, fornecemos evidências adicionais de que nossa técnica pode ser usada para examinar e abordar inconsistências entre dados de localização de proteínas adquiridos pela imunocitoquímica (ICC) e manchas ocidentais. Especificamente, nossa técnica mostrou que: 1) a isoforma proteína quinase C-alfa (PKCα) está presente não apenas em células bipolares, mas também em murine ROS e RIS, embora em baixas concentrações24,25, e 2) rhodopsin quinase (GRK1) está presente predominantemente na amostra isolada do SO. Esses dados demonstram a eficácia de nossas duas técnicas de descascamento para separar e quantificar proteínas específicas de vara e retina.

Protocol

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais locais do comitê de pesquisa em cuidados com animais da Universidade do Sul da Califórnia (USC). 1. Método de peeling de retina de células vivas Preparação dos buffers de Ames, papéis descascando e prato de dissecção Utilizando uma tesoura de íris de ponta cega (ou tipo de tesoura equivalente), corte o papel filtro de celulose (Grau 413) em retângulos medindo aproxima…

Representative Results

As estratégias atuais foram desenvolvidas para fornecer métodos relativamente rápidos e simples para isolar e analisar proteínas entre compartimentos subcelulares específicos da haste para análise de manchas ocidentais. Aplicamos duas técnicas sequenciais de peeling (Figura 1 e Figura 2) seguidas de imunoblotting para demonstrar que esses métodos poderiam ser usados de forma confiável para detectar a distribuição conhecida de transdutina de haste (GNA…

Discussion

Muitas doenças da retina afetam as células fotorreceptoras da haste, levando à morte da haste e, em última instância, à perda completa da visão37. Uma parte significativa das origens genéticas e mecanicistas da degeneração da retina humana foram recapituladas com sucesso em inúmeros modelos de camundongos ao longo dos anos. Nesse contexto, a capacidade de separar facilmente e seletivamente compartimentos subcelulares individuais da pequena retina do rato aumentaria muito nossa compreens…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo NIH Grant EY12155, EY027193 e EY027387 para JC. Somos gratos ao Dr. Spyridon Michalakis (Caltech, Pasadena, EUA) e Natalie Chen (USC, Los Angeles, EUA) por revisar o manuscrito. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Seth Ruffins (USC, Los Angeles, EUA) e ao Dr. Janos Peti-Peterdi (USC, Los Angeles, EUA) por fornecerem os equipamentos necessários para coletar as imagens fornecidas pelo autor. Material de: Kasey Rose et al, Separação de compartimentos celulares fotorreceptor na retina do rato para análise de proteínas, Neurodegeneração Molecular, publicado [2017], [Springer Nature].

Materials

100 mL laboratory or media bottle equipped with a tubing cap adapter N/A N/A
100% O2 tank N/A N/A
1000mL Bottle Top Filter, PES Filter Material, 0.22 μm Genesee Scientific 25-235
4X SDS Sample Buffer Millipore Sigma 70607-3
50 mL Falcon tube Fisher Scientific 14-432-22
95% O2 and 5% CO2 tank N/A N/A
Ames’ Medium with L-glutamine, without bicarbonate Sigma-Aldrich A1420
CaCl2 (99%, dihydrate) Sigma C-3881
Drierite (Anhydrous calcium sulfate, >98% CaSO4, >2% CoCl2) WA Hammond Drierite Co LTD 21005
Falcon Easy-Grip Petri Dish (polystyrene, 35 x 10 mm) Falcon-Corning 08-757-100A
Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish (60 x 15 mm) Falcon-Corning 08-772F
Feather Scalpel (No. 10, 40 mm) VWR 100499-578
Feather Scalpel (No. 11, 40 mm) VWT 100499-580
KCl (99%) Sigma P-4504
Kimble Kontes pellet pestle Sigma z359971
Labconco Fast-Freeze Flasks Labconco N/A
LN2 (liquid nitrogen) + Dewar flask or similar vacuum flask N/A N/A
MgCl2 Sigma M-9272
Milli-Q/de-ionized water EMD Millipore N/A
Na2HPO4 (powder) J.T. Baker 4062-01
NaCl (crystal) EMD Millipore Sx0420-3
NaHCO3 Amresco 0865
OmniPur EDTA EMD 4005
OmniPur HEPES, Free Acid EMD 5320
Parafilm M Sigma-Aldrich P7793
Reynolds Wrap Aluminum Foil Reynolds Brands N/A
Scotch Magic Tape (12.7 mm x 32.9 m) Scotch-3M N/A
Sodium deoxycholate Sigma-Aldrich D67501
Spectrafuge mini centrifuge Labnet International, Inc C1301
Tissue incubation chamber (purchased or custom made) N/A N/A
Tris-HCl J.T.Baker 4103-02
Triton X-100 Signma-Aldrich T8787
VirTis Benchtop 2K Lyophilizer or equivalent machine SP Scientific N/A
VWR Grade 413 Filer Paper (diameter 5.5 cm, pore size 5 μm) VWR 28310-015
Whatman Grade 1 Qualitative Filter Paper (diameter 9 cm, pore size 11 μm) Whatman/GE Healthcare 1001-090
Wide bore transfer pipet, Global Scientific VWR 76285-362

References

  1. Arshavsky, V. Y., Lamb, T. D., Pugh, E. N. G proteins and phototransduction. Annual Review of Physiology. 64, 153-187 (2002).
  2. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  3. Koch, K. W., Dell’Orco, D. Protein and signaling networks in vertebrate photoreceptor cells. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 67 (2015).
  4. Semple-Rowland, S. L., Dawson, W. W. Cyclic light intensity threshold for retinal damage in albino rats raised under 6 lx. Experimental Eye Research. 44 (5), 643-661 (1987).
  5. Brann, M. R., Cohen, L. V. Diurnal expression of transducin mRNA and translocation of transducin in rods of rat retina. Science. 235 (4788), 585-587 (1987).
  6. Philp, N. J., Chang, W., Long, K. Light-stimulated protein movement in rod photoreceptor cells of the rat retina. FEBS Letters. 225 (1-2), 127-132 (1987).
  7. Broekhuyse, R. M., Tolhuizen, E. F., Janssen, A. P., Winkens, H. J. Light induced shift and binding of S-antigen in retinal rods. Current Eye Research. 4 (5), 613-618 (1985).
  8. Roof, D. J., Heth, C. A. Expression of transducin in retinal rod photoreceptor outer segments. Science. 241 (4867), 845-847 (1988).
  9. Sokolov, M., et al. Massive light-driven translocation of transducin between the two major compartments of rod cells: a novel mechanism of light adaptation. Neuron. 34 (1), 95-106 (2002).
  10. Lobanova, E. S., et al. Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex. The Journal of Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).
  11. Strissel, K. J., Sokolov, M., Trieu, L. H., Arshavsky, V. Y. Arrestin translocation is induced at a critical threshold of visual signaling and is superstoichiometric to bleached rhodopsin. The Journal of Neuroscience. 26 (4), 1146-1153 (2006).
  12. Nair, K. S., et al. Light-dependent redistribution of arrestin in vertebrate rods is an energy-independent process governed by protein-protein interactions. Neuron. 46 (4), 555-567 (2005).
  13. Strissel, K. J., et al. Recoverin undergoes light-dependent intracellular translocation in rod photoreceptors. The Journal of Biological Chemistry. 280 (32), 29250-29255 (2005).
  14. Calvert, P. D., Strissel, K. J., Schiesser, W. E., Pugh, E. N., Arshavsky, V. Y. Light-driven translocation of signaling proteins in vertebrate photoreceptors. Trends in Cell Biology. 16 (11), 560-568 (2006).
  15. Majumder, A., et al. Transducin translocation contributes to rod survival and enhances synaptic transmission from rods to rod bipolar cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (30), 12468-12473 (2013).
  16. Fain, G. L. Why photoreceptors die (and why they don’t). BioEssays. 28 (4), 344-354 (2006).
  17. Chen, J., Simon, M. I., Matthes, M. T., Yasumura, D., LaVail, M. M. Increased susceptibility to light damage in an arrestin knockout mouse model of Oguchi disease (stationary night blindness). Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (12), 2978-2982 (1999).
  18. Song, X., et al. Arrestin-1 expression level in rods: balancing functional performance and photoreceptor health. 神经科学. 174, 37-49 (2011).
  19. McConnell, D. G. The isolation of retinal outer segment fragments. The Journal of Cell Biology. 27 (3), 459-473 (1965).
  20. Tsang, S. H., et al. Role for the target enzyme in deactivation of photoreceptor G protein in vivo. Science. 282 (5386), 117-121 (1998).
  21. Walston, S. T., Chow, R. H., Weiland, J. D. Patch clamp recordings of retinal bipolar cells in response to extracellular electrical stimulation in wholemount mouse retina. Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology Society. 2015, 3363-3366 (2015).
  22. Guido, M. E., et al. A simple method to obtain retinal cell preparations highly enriched in specific cell types. Suitability for lipid metabolism studies. Brain Research. Brain Research Protocols. 4 (2), 147-155 (1999).
  23. Hayashi, F., et al. Phosphorylation by cyclin-dependent protein kinase 5 of the regulatory subunit of retinal cGMP phosphodiesterase. II. Its role in the turnoff of phosphodiesterase in vivo. The Journal of Biological Chemistry. 275 (42), 32958-32965 (2000).
  24. Wolbring, G., Cook, N. J. Rapid purification and characterization of protein kinase C from bovine retinal rod outer segments. European Journal of Biochemistry. 201 (3), 601-606 (1991).
  25. Williams, D. S., et al. Characterization of protein kinase C in photoreceptor outer segments. Journal of Neurochemistry. 69 (4), 1693-1702 (1997).
  26. Watson, A. J., Aragay, A. M., Slepak, V. Z., Simon, M. I. A novel form of the G protein beta subunit Gbeta5 is specifically expressed in the vertebrate retina. The Journal of Biological Chemistry. 271 (45), 28154-28160 (1996).
  27. Makino, E. R., Handy, J. W., Li, T., Arshavsky, V. Y. The GTPase activating factor for transducin in rod photoreceptors is the complex between RGS9 and type 5 G protein beta subunit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (5), 1947-1952 (1999).
  28. Chen, J., Shi, G., Concepcion, F. A., Xie, G., Oprian, D. Stable rhodopsin/arrestin complex leads to retinal degeneration in a transgenic mouse model of autosomal dominant retinitis pigmentosa. The Journal of Neuroscience. 26 (46), 11929-11937 (2006).
  29. Chen, C. K., et al. Abnormal photoresponses and light-induced apoptosis in rods lacking rhodopsin kinase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3718-3722 (1999).
  30. Zhang, H., et al. Mistrafficking of prenylated proteins causes retinitis pigmentosa 2. FASEB Journal. 29 (3), 932-942 (2015).
  31. Weiss, E. R., et al. Species-specific differences in expression of G-protein-coupled receptor kinase (GRK) 7 and GRK1 in mammalian cone photoreceptor cells: implications for cone cell phototransduction. The Journal of Neuroscience. 21 (23), 9175-9184 (2001).
  32. Zhao, X., Huang, J., Khani, S. C., Palczewski, K. Molecular forms of human rhodopsin kinase (GRK1). The Journal of Biological Chemistry. 273 (9), 5124-5131 (1998).
  33. Newton, A. C., Williams, D. S. Involvement of protein kinase C in the phosphorylation of rhodopsin. The Journal of Biological Chemistry. 266 (27), 17725-17728 (1991).
  34. Pinzon-Guzman, C., Zhang, S. S., Barnstable, C. J. Specific protein kinase C isoforms are required for rod photoreceptor differentiation. The Journal of Neuroscience. 31 (50), 18606-18617 (2011).
  35. Sokal, I., et al. Identification of protein kinase C isozymes responsible for the phosphorylation of photoreceptor-specific RGS9-1 at Ser475. The Journal of Biological Chemistry. 278 (10), 8316-8325 (2003).
  36. Rose, K., Walston, S. T., Chen, J. Separation of photoreceptor cell compartments in mouse retina for protein analysis. Molecular Neurodegeneration. 12 (1), 28 (2017).
  37. Wright, A. F., Chakarova, C. F., Abd El-Aziz, M. M., Bhattacharya, S. S. Photoreceptor degeneration: genetic and mechanistic dissection of a complex trait. Nature Reviews. Genetics. 11 (4), 273-284 (2010).

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Cite This Article
Rose, K., Lokappa, S., Chen, J. Two Peeling Methods for the Isolation of Photoreceptor Cell Compartments in the Mouse Retina for Protein Analysis. J. Vis. Exp. (178), e62977, doi:10.3791/62977 (2021).

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