Summary

מחקרים של אינטראקציות מלווה-Cochaperone באמצעות אסאי הומוגני מבוסס חרוזים

Published: July 21, 2021
doi:

Summary

פרוטוקול זה מציג טכניקה לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון באמצעות חרוזי תורם הקשורים גלוטתיון עם מלווים שותפים TPR-מוטיב מותך GST וחרוזים מקובלים יחד עם פפטיד שמקורו Hsp90. השתמשנו בטכניקה זו כדי לסנן מולקולות קטנות כדי לשבש Hsp90-FKBP51 או Hsp90-FKBP52 אינטראקציות וזיהינו מעכבי אינטראקציה Hsp90-FKBP51 חזקים וסלקטיביים.

Abstract

מיקוד חלבון הלם חום 90 (Hsp90)-cochaperone אינטראקציות מספק את האפשרות לווסת באופן ספציפי תהליכים תאיים תלוי Hsp90. המחומש המשומר MEEVD בטרמינל C של Hsp90 אחראי לאינטראקציה עם מוטיב חוזר טטרטריקופטיד (TPR) של מלווים משותפים. FK506-מחייב חלבון (FKBP) 51 ו FKBP52 הם שני מלווים שותפים TPR-מוטיב דומה המעורבים במחלות תלויות הורמונים סטרואידים עם פונקציות שונות. לכן, זיהוי מולקולות במיוחד חסימת אינטראקציות בין Hsp90 ו FKBP51 או FKBP52 מספק פוטנציאל טיפולי מבטיח עבור מספר מחלות אנושיות. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול עבור קרבה זוהרת מוגברת כדי לחקור אינטראקציות בין Hsp90 ושותפו מלווים FKBP51 ו- FKBP52. ראשית, טיהרנו את החלבונים המכילים מוטיב TPR FKBP51 ו- FKBP52 בצורת גלוטתיון S-transferase (GST). באמצעות חרוזי התורם הקשורים לגלוטתיון עם חלבוני TPR-מוטיב מותכים GST וחרוזים מקבלים יחד עם פפטיד מסוף C 10-mer של Hsp90, חקרנו אינטראקציות חלבון חלבון בסביבה הומוגנית. השתמשנו בבדיקה זו כדי לסנן מולקולות קטנות כדי לשבש את האינטראקציות Hsp90-FKBP51 או Hsp90-FKBP52 וזיהינו מעכבי אינטראקציה חזקים וסלקטיביים Hsp90-FKBP51.

Introduction

מלווים מולקולריים תורמים להומאוסטזיס של חלבונים, כולל קיפול חלבונים, הובלה והשפלה. הם מווסתים מספר תהליכים תאיים ומקושרים למחלות רבות כגון סרטן ומחלות ניווניות1. חלבון הלם חום 90 (Hsp90) הוא אחד המלווים החשובים ביותר שתפקידם תלוי בשינויים קונפורמיטיביים המונעים על ידי הידרוליזה ATP וקשירה עם חלבוני לקוח בתיווך המלווים השותפים שלה2. למרות הפוטנציאל הברור של Hsp90 כיעד הטיפולי, כוונון עדין של תפקידו מהווה אתגר גדול. ישנם מספר מעכבי Hsp90 המתמקדים באזור איגוד ה- ATP של N-terminal, אשר הוערכו בניסויים קליניים, אך אף אחד מהם לא אושר לשיווק3. בשל היעדר כיס4, המתמקדבאזור ה-C-terminal של Hsp90, זכה להצלחה מוגבלת4. לאחרונה, הפרעה של אינטראקציות Hsp90-cochaperone על ידי מולקולות קטנות נחקרה כאסטרטגיהחלופית 5. מיקוד אינטראקציות Hsp90-cochaperone לא לעורר תגובת מתח תא כללי ומספק את האפשרות לווסת באופן ספציפי תהליכים תאיים שונים. המחומש המשומר MEEVD בטרמינל C של Hsp90 אחראי לאינטראקציה עם מוטיב חוזר טטראטריאופפטייד (TPR) של מלווים משותפים6. מתוך 736 חלבונים המכילים מוטיב TPR המובאים במאגר החלבון האנושי, ~ 20 חלבונים שונים אינטראקציה עם Hsp90 באמצעות פפטידזה 7. מולקולות המתחרות על כריכת הפפטיד של MEEVD ישבשו את האינטראקציות בין Hsp90 למלווים שותפים המכילים תחום TPR. אתר כריכת הפפטידים בעל מבנה שלישוני דומה, אך ההומולוגיה הכוללת בין תחומי מוטיב TPR שונים נמוכה יחסית7, ומספקת הזדמנות לזהות מולקולות המסוגלות במיוחד לחסום אינטראקציות בין Hsp90 לבין מלווים משותפים מסוימים של TPR-מוטיב. בין אלה TPR-מוטיב מלווים משותפים, FK506 מחייב חלבון (FKBP) 51 ו FKBP52 הם רגולטורים של קולטן הורמון סטרואידים (SHR) איתות מעורב במספר מחלות תלויות הורמונים סטרואידים כולל סרטן, מחלות הקשורות ללחץ, מחלות מטבוליות, ומחלתאלצהיימר 8. למרות FKBP51 ו- FKBP52 מניות > דמיון רצף 80%, הפונקציות שלהם שונים: FKBP52 הוא רגולטור חיובי של פעילות SHR, בעוד FKBP51 הוא רגולטור שלילי ברוב המקרים8. לכן, זיהוי מולקולות, במיוחד חסימת אינטראקציות בין Hsp90 ו- FKBP51 או FKBP52, מספק פוטנציאל טיפולי מבטיח למחלות קשורות.

Luminescent Proximity Hאומוגנוס Assay (אלפא מסך) פותח לראשונה בשנת 1994 על ידי אולמן EF ואח‘9. עכשיו הוא נמצא בשימוש נרחב כדי לזהות סוגים שונים של אינטראקציות ביולוגיות, כגון פפטיד10, חלבון11, DNA12,RNA13, וסוכר14. בטכניקה זו, ישנם שני סוגים של חרוזים (קוטר 200 ננומטר), אחד הוא חרוז התורם והשני הוא חרוז הקבלה. הביומולקולים משותקים על החרוזים האלה; האינטראקציות הביולוגיות שלהם מביאות את החרוזים התורמים והמקבלים לקרבה. ב 680 ננומטר, רגישות בצלם בחרוז התורם מאירה וממירה חמצן לחמצן יחיד. מכיוון שלחמצן הסינגל יש חיים קצרים, הוא יכול לפזר רק עד 200 ננומטר. אם חרוז הקבלה נמצא בסמיכות, נגזרת תיוקסן שלה מגיבה עם חמצן יחיד יצירת chemiluminescence ב 370 ננומטר. אנרגיה זו מפעילה עוד יותר פלואורופור באותו חרוז מקבל לפלוט אור ב 520-620 ננומטר15. אם האינטראקציות הביולוגיות משובשות, החרוז המקבל וחרוז התורם אינם יכולים להגיע לקרבה, וכתוצאה מכך דעיכה בחמצן יחיד ואות המיוצר נמוך.

כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות טכניקה זו להקרנת מולקולות קטנות המעכבות אינטראקציות בין Hsp90 ל- TPR מלווים משותפים, במיוחד FKBP51 ו- FKBP52. 10 פפטידים ארוכים של חומצות אמינו המתאימים ל- Hsp90 C-terminus קיצוני מחוברים לחרוזים מקובלים. מלווים שותפים TPR מתויגים GST אינטראקציה עם חרוזי תורם הקשורים גלוטתיון. כאשר האינטראקציה בין פפטידים שמקורם ב-Hsp90 לבין מלווים שותפים של TPR-מוטיב מאחדת את החרוזים, נוצר אות מוגבר(איור 1A). אם המולקולות הקטנות המוקרנות יכולות לעכב את האינטראקציות בין Hsp90 ל-TPR-מוטיב שותפים, האות המוגבר הזה יקטן (איור 1B). ניתן לחשב את IC50 שלהם לפי מדידה כמותית. פרוטוקול זה יכול להיות מורחב לכל מלווה – אינטראקציות שיתוף המלווה TPR-מוטיב של עניין והוא בעל חשיבות רבה בפיתוח של מולקולות חדשניות, במיוחד חסימת האינטראקציה בין Hsp90 ו- FKBP51 או FKBP52.

Figure 1
איור 1: העיקרון הבסיסי של ההסתה הזו. (A)GST-FKBP51 מטוהר מקיים אינטראקציה עם חרוזי תורמים הקשורים לגלוטתיון. 10 פפטידים ארוכים של חומצת אמינו המתאימים לטרמינל C הקיצוני של Hsp90 מחוברים לחרוזים מקובלים. האינטראקציה בין פפטידים שמקורם ב- Hsp90 לבין תחום TPR של FKBP51 מביאה את החרוזים התורמים והמקבלים לקרבה. ב 680 ננומטר, רגישות בצלם בחרוז התורם מאירה וממירה חמצן לחמצן יחיד. נגזרת תיוקסן על חרוז הקבלה מגיבה עם חמצן יחיד ומייצר chemiluminescence ב 370 ננומטר. אנרגיה זו מפעילה עוד יותר פלואורופור באותו חרוז קבלה לפלוט אור ב 520-620 ננומטר. (B)כאשר מולקולות קטנות מעכבות את האינטראקציות בין Hsp90 ל- FKBP51, החרוזים התורמים והמקבלים אינם יכולים להגיע לקרבה. ואז החמצן היחיד עם ריקבון תוחלת חיים קצרה, ולא מיוצר אות לגילוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

הערה: מבט כולל על פרוטוקול זה מוצג באיור 2. 1. ביטוי וטיהור של GST-FKBP51 ו- GST-FKBP52 (איור 2A) פלסמידיםהערה: להשיג שיבוטים cDNA עבור FKBP51 אנושי (מזהה שיבוט: 5723416) עבור FKBP52 אנושי (מזהה שיבוט: 7474554) מקונסורציום IMAGE. להגביר את ה- DNA FKBP51 האנושי ?…

Representative Results

בבדיקה שלנו, יחס ה-Z וה-S/B הם 0.82 ו-13.35, בהתאמה (איור 3A),מה שמוכיח שבדיקת ה-Assay שלנו חזקה ואמינה להקרנה בתפוקה גבוהה. לאחר מכן השתמשנו בו כדי לסנן תרכובות מסה מולקולרית קטנות. איור 3B מציג עיכוב תלוי מינון של אינטראקציות קואצ’אפרון מלווה עם מולקולה קטנה שנבחרה (D10). ?…

Discussion

כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות בדיקה לבדיקה עבור סינון מולקולות קטנות מעכב אינטראקציות בין Hsp90 ו TPR-מוטיב מלווים משותפים, במיוחד FKBP51 ו- FKBP52. ציון ה-Z הגבוה שלו (>0.8) מדגים את החוסן והאמינות לפורמט בעל תפוקה גבוהה. התוצאות ניתן להשיג בתוך שעה אחת, כמויות קטנות של חרוזים, חלבון ותרכובות נדרשים. ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים ממועצת המחקר השוודית (2018-02843), קרן המוח (Fo 2019-0140), הקרן למחלות גריאטריות במכון קרולינסקה, קרן גונוור ויוסף אנר, קרן מגנוס ברגוולס, קרן אקדח וברטל סטונס, קרן טורה נילסון למחקר רפואי, קרן מרגרטה af Ugglas והקרן למשרתים זקנים.

Materials

384-well plates Perkin Elmer 6008350 Assay volume 25 ml
Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit Millipore UFC901008 Concentrate protein
Ampicillin Sigma A0166 Antibiotics
Bacteria shaker Unimax 1010 Heidolph Culture bacteria
cDNA clones for human FKBP51 Source BioScience clone id: 5723416 pCMV-SPORT6 vector
cDNA clones for human FKBP52 Source BioScience clone id: 7474554 pCMV-SPORT6 vector
Chemically Competent E. coli Invitrogen C602003 One Shot BL21 Star (DE3)
Data analysis software GraphPad Prism 9.0.0 Analysis data and make figures
Data analysis software Excel Analysis data
DMSO Supelco 1.02952.1000 Dilute compounds
DPBS Gibco 14190-144 Prepare solution
EDTA Calbiochem 344504 Prevent proteolysis during sonication
Glutathione Sigma G-4251 Elute GST-tagged proteins
Glutathione donor beads Perkin Elmer 6765300 Donor bead
GST-trap column Cytiva (GE Healthcare) 17528201 Purify GST-tagged proteins
Isopropyl-β-D-thiogalactoside Thermo Fisher Scientific R0392 Induce protein expression
LB Broth (Miller) Sigma L3522 Microbial growth medium
PCR instrument BIO-RAD S1000 Thermal Cycler Amplification/PCR
PD-10 column Cytiva (GE Healthcare) 17085101 Solution exchange
pGEX-6P-1 vector Cytiva (GE Healthcare) 28954648 Plasmid
pGEX-6P-2 vector Cytiva (GE Healthcare) 28954650 Plasmid
Plate reader Perkin Elmer EnSpire 2300 Multilabel Reader Read alpha plate
Plate reader software Perkin Elmer EnSpire Manager Plate reader software
Plate reader software protocol Perkin Elmer Alpha 384-well Low volume Use this protocol to read plate
PMSF Sigma P7626 Prevent proteolysis during sonication
protease inhibitor cocktail Sigma S8830 Prevent proteolysis during sonication
Sodium azide Sigma S2002 As a preservative
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma 156159 Activates matrix for coupling
Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform Peptide 2.0 inc Synthesize Hsp90 C-terminal peptide
Test-Tube Rotator LABINCO Make end-over-end agitation
Tris-HCl Sigma 10708976001 Block unreacted sites of acceptor beads
Tween-20 Sigma P1379 Prevent beads aggregation
Ultra centrifuge Avanti J-20 XP Beckman Coulter Centrifuge to get bacteria cell pellets
Ultrasonic cell disruptor Microson Sonicate cells to release protein
Unconjugated acceptor beads Perkin Elmer 6762003 Acceptor beads
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Invitrogen EI0002 SDS-PAGE

References

  1. Muchowski, P. J., Wacker, J. L. Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones. Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).
  2. Eckl, J. M., Richter, K. Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).
  3. Yuno, A. Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).
  4. Dutta Gupta, S., Bommaka, M. K., Banerjee, A. Inhibiting protein-protein interactions of Hsp90 as a novel approach for targeting cancer. European Journal of Medicinal Chemistry. 178, 48-63 (2019).
  5. Pavlov, P. F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer’s disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).
  6. Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90. Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).
  7. Scheufler, C., et al. Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine. Cell. 101 (2), 199-210 (2000).
  8. Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease. Trends in Endocrinology & Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).
  9. Ullman, E. F., et al. Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).
  10. Wigle, T. J., et al. Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins. Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).
  11. Guenat, S., et al. Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates. Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).
  12. Sabatucci, A., et al. A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV. Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720 (2020).
  13. Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).
  14. Huang, X., et al. A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan. Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).
  15. Principles of alphascreen amplified luinescent proximmity homogenous assay. PerkinElmer Life Sciences Available from: https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf (2021)
  16. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).

Play Video

Cite This Article
Wang, L., Bergkvist, L., Kumar, R., Winblad, B., Pavlov, P. F. Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay. J. Vis. Exp. (173), e62762, doi:10.3791/62762 (2021).

View Video