Summary

دراسات التفاعلات Chaperone-Cochaperone باستخدام المتجانسة حبة القائم على المقايسة

Published: July 21, 2021
doi:

Summary

يقدم هذا البروتوكول تقنية للتحقيق في التفاعلات بين البروتين والبروتين باستخدام حبات المانحين المرتبطة بالجلوتاثيون مع مرافقين مشاركين من TPR-motif من GST وخرزات مقبولة إلى جانب ببتيد مشتق من Hsp90. لقد استخدمنا هذه التقنية لفحص الجزيئات الصغيرة لتعطيل تفاعلات Hsp90-FKBP51 أو Hsp90-FKBP52 وحددنا مثبطات تفاعل Hsp90-FKBP51 القوية والانتقائية.

Abstract

استهداف بروتين الصدمة الحرارية 90 (Hsp90) – التفاعلات cochaperone يوفر إمكانية لتنظيم العمليات على وجه التحديد Hsp90 تعتمد داخل الخلايا. وPENtapeptide MEEVD المحفوظة في C-terminus من Hsp90 هو المسؤول عن التفاعل مع تكرار رباعية التريتريكبتيد (TPR) عزر المرافقين المشاركين. بروتين FK506 ملزمة (FKBP) 51 و FKBP52 هما مماثلة TPR عزر المرافقين المشاركين المشاركين في الأمراض التي تعتمد على هرمون الستيرويد مع وظائف مختلفة. لذلك ، فإن تحديد الجزيئات التي تمنع التفاعلات بين Hsp90 و FKBP51 أو FKBP52 يوفر إمكانات علاجية واعدة للعديد من الأمراض البشرية. هنا، ونحن نصف بروتوكول لتضخيم القرب الإنارة المقايسة متجانسة للتحقيق التفاعلات بين Hsp90 وشريكها المرافقين FKBP51 و FKBP52. أولا، قمنا بتنقية البروتينات المحتوية على TPR FKBP51 و FKBP52 في شكل الجلوتاثيون S-transferase (GST) الموسومة. باستخدام حبات المانحين المرتبطة الجلوتاثيون مع البروتينات TPR-عزر GST تنصهر والخرز مقبول إلى جانب 10 مير C-محطة الببتيد من Hsp90, لقد بحثت التفاعلات البروتين البروتين في بيئة متجانسة. لقد استخدمنا هذا المقايسة لفحص الجزيئات الصغيرة لتعطيل تفاعلات Hsp90-FKBP51 أو Hsp90-FKBP52 وحددنا مثبطات تفاعل Hsp90-FKBP51 القوية والانتقائية.

Introduction

المرافقين الجزيئية تسهم في التوازن البروتين، بما في ذلك طي البروتين، والنقل، والتدهور. وهي تنظم العديد من العمليات الخلوية وترتبط بالعديد من الأمراض مثل السرطان والأمراض العصبية1. بروتين الصدمة الحرارية 90 (Hsp90) هي واحدة من أهم المرافقين الذين تعتمد وظيفتهم على التغيرات تشكيلية مدفوعة تحليل هيدروليسيس ATP وملزمة مع البروتينات العميل بوساطة المرافقين المشاركين2. على الرغم من الإمكانات الواضحة ل Hsp90 كهدف علاجي ، فإن ضبط وظيفته يمثل تحديا كبيرا. هناك العديد من مثبطات Hsp90 التي تستهدف منطقة ربط ATP N-terminal ، والتي تم تقييمها في التجارب السريرية ، ولكن لم تتم الموافقة على أي منها للتسويق3. نظرا لعدم وجود جيب ملزم ليغاند محددة جيدا4، واستهداف منطقة C-محطة Hsp90 كان نجاحا محدودا4. في الآونة الأخيرة ، تم التحقيق في تعطيل تفاعلات Hsp90-cochaperone بواسطة جزيئات صغيرة كاستراتيجية بديلة5. استهداف التفاعلات Hsp90-cochaperone لن تثير استجابة الإجهاد الخلية العامة ويوفر إمكانية لتنظيم العمليات داخل الخلايا على وجه التحديد. وPENtapeptide MEEVD المحفوظة في C-terminus من Hsp90 هو المسؤول عن التفاعل مع تكرار رباعية الترغيببتيد (TPR) عزر المرافقين المشاركين6. من 736 TPR البروتينات التي تحتوي على عزر المشروح في قاعدة بيانات البروتين البشري، ~ 20 البروتينات المختلفة تتفاعل مع Hsp90 عبر هذا الببتيد7. الجزيئات المتنافسة على MEEVD الببتيد ملزمة من شأنه أن يعطل التفاعلات بين Hsp90 والمرافقين المشاركين التي تحتوي على مجال TPR. يحتوي موقع ربط الببتيد على بنية ثالثة مماثلة ولكن التماثل العام بين نطاقات عزر TPR المختلفة منخفض نسبيا7، مما يوفر فرصة لتحديد الجزيئات القادرة على منع التفاعلات بين Hsp90 والمرافقين المشاركين في TPR-motif. من بين هذه TPR عزر المرافقين المشاركين, FK506 ملزمة البروتين (FKBP) 51 و FKBP52 هي المنظمين لمستقبلات هرمون الستيرويد (SHR) الإشارات والمشاركة في العديد من الأمراض التي تعتمد على هرمون الستيرويد بما في ذلك السرطان, الأمراض المرتبطة بالإجهاد, أمراض التمثيل الغذائي, ومرض الزهايمر8. على الرغم من أن FKBP51 و FKBP52 يشتركان > تشابه تسلسلي بنسبة 80٪، إلا أن وظائفهما تختلف: FKBP52 هو منظم إيجابي لنشاط SHR، في حين أن FKBP51 هو منظم سلبي في معظم الحالات8. لذلك ، فإن تحديد الجزيئات ، على وجه التحديد منع التفاعلات بين Hsp90 و FKBP51 أو FKBP52 ، يوفر إمكانات علاجية واعدة للأمراض ذات الصلة.

تمتطوير Luminescent Proximity Homogenous A ssay(AlphaScreen) لأول مرة في عام 1994 من قبل أولمان EF وآخرون. الآن يتم استخدامه على نطاق واسع للكشف عن أنواع مختلفة من التفاعلات البيولوجية، مثل الببتيد10،البروتين11،الحمض النووي12،RNA13،والسكر14. في هذه التقنية، هناك نوعان من الخرز (قطرها 200 نانومتر)، واحد هو حبة المانحة والآخر هو حبة المقبول. يتم شل الجزيئات الحيوية على هذه الخرز؛ تفاعلاتها البيولوجية تجلب الخرز المانحة والمقبل في القرب. في 680 نانومتر، ينير حساس للضوء في حبة المتبرع ويحول الأكسجين إلى أكسجين مفرد. لأن الأكسجين المفرد له عمر قصير ، فإنه يمكن أن ينتشر فقط حتى 200 نانومتر. إذا كان حبة المقبول على مقربة، مشتق ثيوكسيني يتفاعل مع الأكسجين المفرد توليد chemiluminescence في 370 نانومتر. هذه الطاقة ينشط كذلك الفلوروفوريس في حبة المقبول نفسه لتنبعث منها ضوء في 520-620 نانومتر15. إذا تعطلت التفاعلات البيولوجية ، لا يمكن أن تصل حبة المقبول وخرزة المتبرع إلى القرب ، مما يؤدي إلى تسوس الأكسجين المفرد والإشارة المنخفضة المنتجة.

هنا نحن نصف بروتوكول باستخدام هذه التقنية لفحص جزيئات صغيرة تمنع التفاعلات بين Hsp90 و TPR المرافقين المشاركين، وخاصة FKBP51 و FKBP52. يتم إرفاق الببتيدات 10 الأحماض الأمينية طويلة المقابلة لHsp90 المدقع C-terminus إلى حبات acceptor. يتفاعل المرافقون المشاركون في TPR الموسومون ب GST المنقى مع حبات المتبرعين المرتبطة بالجلوتاثيون. عندما التفاعل بين الببتيدات Hsp90 المشتقة وتي بي آر عزر المرافقين المشارك يجمع الخرز معا، يتم إنتاج إشارة مكبرة(الشكل 1A). إذا كانت الجزيئات الصغيرة التي تم فحصها يمكن أن تمنع التفاعلات بين Hsp90 و TPR-motif المرافقين المشاركين، سيتم تقليل هذه الإشارة مكبرة(الشكل 1B). ويمكن حساب IC50 من خلال القياس الكمي. يمكن توسيع نطاق هذا البروتوكول ليشمل أي مرافق – تفاعلات مرافق مشارك في TPR-motif ذات أهمية كبيرة في تطوير جزيئات جديدة ، مما يمنع على وجه التحديد التفاعل بين Hsp90 و FKBP51 أو FKBP52.

Figure 1
الشكل 1:المبدأ الأساسي لهذا المقايسة. (أ) تنقية GST-FKBP51 يتفاعل مع حبات المانحين المرتبطة الجلوتاثيون. يتم إرفاق الببتيدات 10 الأحماض الأمينية طويلة المقابلة لC-terminus المتطرفة من Hsp90 إلى حبات acceptor. التفاعل بين الببتيدات المشتقة من Hsp90 ومجال TPR من FKBP51 يجعل المتبرع والخرز المقبول في القرب. في 680 نانومتر، ينير حساس للضوء في حبة المتبرع ويحول الأكسجين إلى أكسجين مفرد. مشتق الثيوكسيني على حبة المقبول يتفاعل مع الأكسجين المفرد ويولد chemiluminescence في 370 نانومتر. هذه الطاقة ينشط كذلك الفلوروفوريس في حبة المقبول نفسه لتنبعث منها الضوء في 520-620 نانومتر. (ب)عندما تمنع الجزيئات الصغيرة التفاعلات بين Hsp90 و FKBP51 ، لا يمكن للخرز المانح والمقبل الوصول إلى القرب. ثم الأكسجين المفرد مع تسوس العمر القصير ، ولا يتم إنتاج إشارة يمكن اكتشافها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

ملاحظة: يتم عرض نظرة عامة حول هذا البروتوكول في الشكل 2. 1. التعبير وتنقية GST-FKBP51 وGST-FKBP52 (الشكل 2A) البلازميداتملاحظة: الحصول على استنساخ cDNA لFKBP51 الإنسان (معرف استنساخ: 5723416) وFKBP52 الإنسان (استنساخ معرف: 7474554) من اتحاد IMAGE. تضخيم…

Representative Results

في المقايسة لدينا، عامل Z ونسبة S/ B هي 0.82 و 13.35، على التوالي(الشكل 3A)،مما يدل على أن لدينا المقايسة قوية وموثوق بها لفحص عالية الإنتاجية. ثم استخدمناه لفحص المركبات الجزيئية الصغيرة. الشكل 3B يقدم تثبيط تعتمد على الجرعة من التفاعلات المرافقين-cochaperone مع جزيء صغ?…

Discussion

هنا نصف بروتوكول باستخدام المقايسة لفحص الجزيئات الصغيرة التي تمنع التفاعلات بين Hsp90 و TPR-motif المرافقين المشاركين ، وخاصة FKBP51 و FKBP52. درجة Z العالية (>0.8) توضح متانة وموثوقية تنسيق عالي الإنتاجية. يمكن الحصول على النتائج في غضون ساعة واحدة، وهناك حاجة إلى كميات صغيرة من الخرز والبروتين والمرك?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة من خلال منح من مجلس البحوث السويدي (2018-02843) ومؤسسة الدماغ (Fo 2019-0140) ومؤسسة أمراض الشيخوخة في معهد كارولينسكا ومؤسسة غونفور وجوزيف أنيرز ومؤسسة ماغنوس بيرغفالس ومؤسسة غون وبيرتيل ستونيس ومؤسسة توري نيلسون للأبحاث الطبية ومؤسسة مارغريتا إيه أوغلاس ومؤسسة الخدم القدامى.

Materials

384-well plates Perkin Elmer 6008350 Assay volume 25 ml
Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit Millipore UFC901008 Concentrate protein
Ampicillin Sigma A0166 Antibiotics
Bacteria shaker Unimax 1010 Heidolph Culture bacteria
cDNA clones for human FKBP51 Source BioScience clone id: 5723416 pCMV-SPORT6 vector
cDNA clones for human FKBP52 Source BioScience clone id: 7474554 pCMV-SPORT6 vector
Chemically Competent E. coli Invitrogen C602003 One Shot BL21 Star (DE3)
Data analysis software GraphPad Prism 9.0.0 Analysis data and make figures
Data analysis software Excel Analysis data
DMSO Supelco 1.02952.1000 Dilute compounds
DPBS Gibco 14190-144 Prepare solution
EDTA Calbiochem 344504 Prevent proteolysis during sonication
Glutathione Sigma G-4251 Elute GST-tagged proteins
Glutathione donor beads Perkin Elmer 6765300 Donor bead
GST-trap column Cytiva (GE Healthcare) 17528201 Purify GST-tagged proteins
Isopropyl-β-D-thiogalactoside Thermo Fisher Scientific R0392 Induce protein expression
LB Broth (Miller) Sigma L3522 Microbial growth medium
PCR instrument BIO-RAD S1000 Thermal Cycler Amplification/PCR
PD-10 column Cytiva (GE Healthcare) 17085101 Solution exchange
pGEX-6P-1 vector Cytiva (GE Healthcare) 28954648 Plasmid
pGEX-6P-2 vector Cytiva (GE Healthcare) 28954650 Plasmid
Plate reader Perkin Elmer EnSpire 2300 Multilabel Reader Read alpha plate
Plate reader software Perkin Elmer EnSpire Manager Plate reader software
Plate reader software protocol Perkin Elmer Alpha 384-well Low volume Use this protocol to read plate
PMSF Sigma P7626 Prevent proteolysis during sonication
protease inhibitor cocktail Sigma S8830 Prevent proteolysis during sonication
Sodium azide Sigma S2002 As a preservative
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma 156159 Activates matrix for coupling
Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform Peptide 2.0 inc Synthesize Hsp90 C-terminal peptide
Test-Tube Rotator LABINCO Make end-over-end agitation
Tris-HCl Sigma 10708976001 Block unreacted sites of acceptor beads
Tween-20 Sigma P1379 Prevent beads aggregation
Ultra centrifuge Avanti J-20 XP Beckman Coulter Centrifuge to get bacteria cell pellets
Ultrasonic cell disruptor Microson Sonicate cells to release protein
Unconjugated acceptor beads Perkin Elmer 6762003 Acceptor beads
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Invitrogen EI0002 SDS-PAGE

References

  1. Muchowski, P. J., Wacker, J. L. Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones. Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).
  2. Eckl, J. M., Richter, K. Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).
  3. Yuno, A. Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).
  4. Dutta Gupta, S., Bommaka, M. K., Banerjee, A. Inhibiting protein-protein interactions of Hsp90 as a novel approach for targeting cancer. European Journal of Medicinal Chemistry. 178, 48-63 (2019).
  5. Pavlov, P. F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer’s disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).
  6. Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90. Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).
  7. Scheufler, C., et al. Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine. Cell. 101 (2), 199-210 (2000).
  8. Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease. Trends in Endocrinology & Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).
  9. Ullman, E. F., et al. Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).
  10. Wigle, T. J., et al. Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins. Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).
  11. Guenat, S., et al. Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates. Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).
  12. Sabatucci, A., et al. A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV. Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720 (2020).
  13. Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).
  14. Huang, X., et al. A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan. Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).
  15. Principles of alphascreen amplified luinescent proximmity homogenous assay. PerkinElmer Life Sciences Available from: https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf (2021)
  16. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).

Play Video

Cite This Article
Wang, L., Bergkvist, L., Kumar, R., Winblad, B., Pavlov, P. F. Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay. J. Vis. Exp. (173), e62762, doi:10.3791/62762 (2021).

View Video