Summary

Microdissection du cerveau de souris en régions fonctionnellement et anatomiquement différentes

Published: February 15, 2021
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Summary

Nous présentons un protocole pratique, étape par étape, rapide pour l’ablation du cerveau de souris et la dissection de régions discrètes à partir de tissus cérébraux frais. L’obtention de régions cérébrales pour l’analyse moléculaire est devenue une routine dans de nombreux laboratoires de neurosciences. Ces régions du cerveau sont immédiatement congelées pour obtenir des données transcriptomiques de haute qualité pour l’analyse au niveau du système.

Abstract

Le cerveau est le centre de commande du système nerveux des mammifères et un organe doté d’une énorme complexité structurelle. Protégé à l’intérieur du crâne, le cerveau est constitué d’une enveloppe externe de matière grise sur les hémisphères connue sous le nom de cortex cérébral. Sous cette couche résident de nombreuses autres structures spécialisées qui sont essentielles pour de multiples phénomènes importants pour l’existence. L’acquisition d’échantillons de régions cérébrales macroscopiques spécifiques nécessite des étapes de dissection rapides et précises. Il est entendu qu’au niveau microscopique, de nombreuses sous-régions existent et traversent probablement les frontières régionales arbitraires que nous imposons aux fins de cette dissection.

Les modèles murins sont couramment utilisés pour étudier les fonctions cérébrales humaines et les maladies. Les changements dans les schémas d’expression génique peuvent être limités à des zones spécifiques du cerveau ciblant un phénotype particulier en fonction de l’état malade. Ainsi, il est d’une grande importance d’étudier la régulation de la transcription par rapport à son organisation structurelle bien définie. Une compréhension complète du cerveau nécessite d’étudier des régions cérébrales distinctes, de définir des connexions et d’identifier les différences clés dans les activités de chacune de ces régions du cerveau. Une compréhension plus complète de chacune de ces régions distinctes pourrait ouvrir la voie à des traitements nouveaux et améliorés dans le domaine des neurosciences. Ici, nous discutons d’une méthodologie étape par étape pour disséquer le cerveau de la souris en seize régions distinctes. Dans cette procédure, nous nous sommes concentrés sur l’ablation et la dissection cérébrale de souris mâles C57Bl / 6J (6-8 semaines) dans plusieurs régions en utilisant des repères neuroanatomiques pour identifier et échantillonner des régions cérébrales discrètes fonctionnellement pertinentes et comportementales. Ce travail aidera à établir une base solide dans le domaine des neurosciences, menant à des approches plus ciblées dans la compréhension plus profonde de la fonction cérébrale.

Introduction

Le cerveau, ainsi que la moelle épinière et la rétine, constituent le système nerveux central qui exécute des comportements complexes, contrôlés par des types de cellules spécialisées, positionnées avec précision et en interaction dans tout le corps1. Le cerveau est un organe complexe avec des milliards de neurones interconnectés et de glies avec des circuits précis remplissant de nombreuses fonctions. C’est une structure bilatérale avec deux lobes distincts et divers composants cellulaires2. La moelle épinière relie le cerveau au monde extérieur et est protégée par les os, les méninges et le liquide céphalorachidien et achemine les messages vers et depuis le cerveau 2,3,4. La surface du cerveau, le cortex cérébral, est inégale et possède des plis distincts, appelés gyri, et des rainures, appelées sulci, qui séparent le cerveau en centres fonctionnels5. Le cortex est lisse chez les mammifères avec un petit cerveau 6,7. Il est important de caractériser et d’étudier l’architecture du cerveau humain afin de comprendre les troubles liés aux différentes régions du cerveau, ainsi que ses circuits fonctionnels. La recherche en neurosciences s’est développée ces dernières années et diverses méthodes expérimentales sont utilisées pour étudier la structure et la fonction du cerveau. Les développements dans les domaines de la biologie moléculaire et systémique ont inauguré une nouvelle ère d’exploration de la relation complexe entre les structures cérébrales et le fonctionnement des molécules. De plus, la biologie moléculaire, la génétique et l’épigénétique se développent rapidement, ce qui nous permet de faire progresser nos connaissances sur les mécanismes sous-jacents impliqués dans le fonctionnement des systèmes. Ces analyses peuvent être effectuées sur une base beaucoup plus localisée, pour aider à cibler l’investigation et le développement de thérapies plus efficaces.

Le cerveau des mammifères est structurellement défini en régions discrètes clairement identifiables; Cependant, les complexités fonctionnelles et moléculaires de ces structures discrètes ne sont pas encore clairement comprises. La nature multidimensionnelle et multicouche du tissu cérébral rend ce paysage difficile à étudier au niveau fonctionnel. De plus, le fait que plusieurs fonctions soient assurées par la même structure et vice versa complique encore la compréhension du cerveau8. Il est essentiel que l’approche expérimentale exécutée pour la caractérisation structurelle et fonctionnelle des régions cérébrales utilise des méthodologies de recherche précises pour parvenir à une cohérence dans l’échantillonnage pour corréler l’architecture neuroanatomique avec la fonction. La complexité du cerveau a été récemment expliquée en utilisant le séquençage unicellulaire 9,10 tel que le gyrus temporal du cerveau humain qui est composé de 75 types cellulaires distincts 11. En comparant ces données à celles d’une région analogue du cerveau de la souris, l’étude révèle non seulement des similitudes dans leur architecture et leurs types de cellules, mais présente également les différences. Pour démêler les mécanismes complexes, il est donc important d’étudier diverses régions du cerveau avec une précision totale. Les structures et la fonction conservées entre un cerveau humain et un cerveau de souris permettent l’utilisation d’une souris comme substitut préliminaire pour élucider la fonction cérébrale humaine et les résultats comportementaux.

Avec l’avancement des approches de biologie des systèmes, l’obtention d’informations à partir de régions cérébrales discrètes chez les rongeurs est devenue une procédure clé dans la recherche en neurosciences. Alors que certains protocoles tels que la microdissection par capture laser12 peuvent être coûteux, les protocoles mécaniques sont peu coûteux et réalisés à l’aide d’outils couramment disponibles13,14. Nous avons utilisé plusieurs régions du cerveau pour des tests transcriptomiques15 et avons développé une procédure pratique et rapide pour disséquer les régions cérébrales d’intérêt de souris étape par étape en peu de temps. Une fois disséqués, ces échantillons peuvent être stockés immédiatement dans des conditions froides pour préserver les acides nucléiques et les protéines de ces tissus. Notre approche peut être réalisée plus rapidement, ce qui conduit à une efficacité élevée et permet moins de risques de détérioration des tissus. En fin de compte, cela augmente les chances de générer des expériences reproductibles de haute qualité utilisant des tissus cérébraux.

Protocol

Les procédures de manipulation et d’expérimentation des animaux ont été menées conformément aux directives européennes, nationales et institutionnelles en matière de soins aux animaux. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) du Centre de recherche sur la santé environnementale de l’armée américaine, maintenant Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) et réalisées dans un établissement accrédité par l’Association …

Representative Results

Notre compréhension de la structure et de la fonction complexes du cerveau évolue et s’améliore rapidement. Le cerveau contient plusieurs régions distinctes et la construction d’une carte moléculaire peut nous aider à mieux comprendre le fonctionnement du cerveau. Dans cet article de méthode, nous avons discuté de la dissection du cerveau de la souris en plusieurs régions distinctes (tableau 1). Dans ce protocole, les structures sont identifiées en fonction des repères critiques et sont ob…

Discussion

Le cerveau des mammifères est un organe complexe composé d’un ensemble de cellules morphologiquement distinctes et fonctionnellement uniques avec diverses signatures moléculaires et de multiples régions qui remplissent des fonctions spécialisées et discrètes. La procédure de dissection décrite ici peut avoir plusieurs objectifs en fonction des exigences du laboratoire. Dans notre laboratoire, nous avons évalué la transcription dans plusieurs régions du cerveau recueillies chez des souris exposées au SSPT c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Mme Seshmalini Srinivasan, M. Stephen Butler et Mme Pamela Spellman pour leur aide expérimentale et Mme Dana Youssef pour l’édition du manuscrit. Le soutien financier de l’USAMRDC est vivement apprécié. La Fondation genevoise a contribué à ce travail et a été soutenue par des fonds de la Direction III du domaine de recherche en médecine militaire et opérationnelle via le US Army Research Office.

Démenti:

Le matériel a été examiné par le Walter Reed Army Institute of Research. Il n’y a pas d’objection à sa présentation et/ou à sa publication. Les opinions ou affirmations contenues dans le présent document sont les opinions privées de l’auteur et ne doivent pas être interprétées comme officielles ou comme reflétant de véritables opinions du Département de l’Armée ou du Département de la Défense. La recherche a été menée dans le cadre d’un protocole d’utilisation des animaux approuvé dans une installation accréditée par l’AAALAC, conformément à la Loi sur le bien-être des animaux et à d’autres lois et règlements fédéraux relatifs aux animaux et aux expériences avec des animaux, et adhère aux principes énoncés dans le Guide sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, publication du CNRC, édition 2011.

Materials

Brain Removal
Deaver scissors Roboz Surgical Store RS-6762 5.5" straight sharp/sharp
Deaver scissors Roboz Surgical Store RS-6763 5.5" curved sharp/sharp
Delicate operating scissors Roboz Surgical Store RS-6703 4.75" curved sharp/sharp
Delicate operating scissors Roboz Surgical Store RS-6702 4.75" straight sharp/sharp
Light operating scissors Roboz Surgical Store RS-6753 5" curved Sharp/Sharp
Micro spatula, radius and tapered flat ends stainless steel mirror finish
Operating scissors 6.5" Roboz Surgical Store RS-6846 curved sharp/sharp
Tissue forceps Roboz Surgical Store RS-8160 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width
Rongeur (optional) Roboz Surgical Store RS-8321 many styles to choose Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm
Pituitary Dissection
Scalpel handle Roboz Surgical Store RS-9843 Scalpel Handle #3 Solid 4"
and blades Roboz Surgical Store RS-9801-11 Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm
Super fine forceps Inox Roboz Surgical Store RS-4955 tip size 0.025 X 0.005 mm
Brain Dissection
A magnification visor Penn Tool Col 40-178-6 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier
Dissection cold plate Cellpath.com JRI-0100-00A Iceberg cold plate & base
Graefe forceps, full curve extra delicate Roboz Surgical Store RS-5138 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long
Light operating scissors Roboz Surgical Store RS-6753 5" curved sharp/sharp
Scalpel handle Roboz Surgical Store RS-9843 (repeated above) Scalpel Handle #3 Solid 4"
and blades (especially #11) Roboz Surgical Store RS-9801-11 (repeated above) Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm
Spatula Amazon MS-SQRD9-4 Double Ended Spatula Square AND Round End
Tissue forceps Roboz Surgical Store RS-8160 (repeated above) 4.5” 1X2 teeth

References

  1. Zeisel, A., et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
  2. Ackerman, S. . Major Structures and Functions of the Brain. 2, (1992).
  3. P, T. L. S. . StatPearls. , (2019).
  4. Paramvir, T. L. S. . StatPearls. , (2019).
  5. Javed, K., Reddy, V., et al. . Neuroanatomy, Cerebral Cortex. , (2020).
  6. Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neuroscience. 10 (10), 724-735 (2009).
  7. Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  8. Pessoa, L. Understanding brain networks and brain organization. Physics of Life Reviews. 11 (3), 400-435 (2014).
  9. Mu, Q., Chen, Y., Wang, J. Deciphering Brain Complexity Using Single-cell Sequencing. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 17 (4), 344-366 (2019).
  10. Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7285-7290 (2015).
  11. Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
  12. Winrow, C. J., et al. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain Research. 1271, 1-17 (2009).
  13. Atkins, N., Miller, C. M., Owens, J. R., Turek, F. W. Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling. Journal of Visualized Experiments. (57), e3125 (2011).
  14. Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
  15. Muhie, S., et al. Brain transcriptome profiles in mouse model simulating features of post-traumatic stress disorder. Molecular Brain. 8, 14 (2015).
  16. Hammamieh, R., et al. Murine model of repeated exposures to conspecific trained aggressors simulates features of post-traumatic stress disorder. Behavioural Brain Research. 235 (1), 55-66 (2012).
  17. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 3rd edn. , (2008).
  18. Franklin, K., Paxinos, G. . The Coronal Plates and Diagrams. , (2019).
  19. Slotnick, B. M., Leonard, C. M. Stereotaxic atlas of the albino mouse forebrain. Rockville, MD, Alcohol, Drug Abuse and Mental Health Administration, 1975. Annals of Neurology. 10 (4), 403-403 (1981).
  20. Cajal, S. R., Swanson, N., Swanson, L. W. . Histologie Du Système Nerveux de L’homme Et Des Vertébrés. Anglais. , (1995).
  21. Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuromethods. 57, 13-26 (2011).
  22. Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
  23. Sultan, F. A. Dissection of Different Areas from Mouse Hippocampus. Bio Protocols. 3 (21), (2013).
  24. Chakraborty, N., et al. Gene and stress history interplay in emergence of PTSD-like features. Behavioural Brain Research. 292, 266-277 (2015).
  25. Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -. F., Chang, R. C. -. C. Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region. Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).
  26. Rajmohan, V., Mohandas, E. The limbic system. Indian Journal of Psychiatry. 49 (2), 132-139 (2007).

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Cite This Article
Meyerhoff, J., Muhie, S., Chakraborty, N., Naidu, L., Sowe, B., Hammamieh, R., Jett, M., Gautam, A. Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions. J. Vis. Exp. (168), e61941, doi:10.3791/61941 (2021).

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