Fare Beyninin İşlevsel ve Anatomik Olarak Farklı Bölgelere Mikrodiseksiyonu
Summary
Fare beyninin çıkarılması ve taze beyin dokusundan ayrı bölgelerin diseksiyonu için uygulamalı, adım adım, hızlı bir protokol sunuyoruz. Moleküler analiz için beyin bölgelerinin elde edilmesi birçok sinirbilim laboratuvarında rutin hale gelmiştir. Bu beyin bölgeleri, sistem seviyesi analizi için yüksek kaliteli transkriptomik veriler elde etmek için hemen dondurulur.
Abstract
Beyin, memeli sinir sisteminin komuta merkezi ve muazzam yapısal karmaşıklığa sahip bir organdır. Kafatasının içinde korunan beyin, serebral korteks olarak bilinen yarımküreler üzerindeki gri cevherin dış kaplamasından oluşur. Bu katmanın altında, varoluş için önemli olan çoklu fenomenler için gerekli olan birçok başka özel yapı bulunur. Belirli brüt beyin bölgelerinin örneklerini elde etmek, hızlı ve hassas diseksiyon adımları gerektirir. Mikroskobik düzeyde, birçok alt bölgenin var olduğu ve muhtemelen bu diseksiyonun amacı için dayattığımız keyfi bölgesel sınırları aştığı anlaşılmaktadır.
Fare modelleri, insan beyninin fonksiyonlarını ve hastalıklarını incelemek için rutin olarak kullanılır. Gen ekspresyon modellerindeki değişiklikler, hastalıklı duruma bağlı olarak belirli bir fenotipi hedef alan belirli beyin bölgeleriyle sınırlı olabilir. Bu nedenle, transkripsiyonun düzenlenmesini iyi tanımlanmış yapısal organizasyonu açısından incelemek büyük önem taşımaktadır. Beynin tam olarak anlaşılması, farklı beyin bölgelerini incelemeyi, bağlantıları tanımlamayı ve bu beyin bölgelerinin her birinin faaliyetlerindeki temel farklılıkları tanımlamayı gerektirir. Bu farklı bölgelerin her birinin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılması, sinirbilim alanında yeni ve geliştirilmiş tedavilerin yolunu açabilir. Burada, fare beynini on altı farklı bölgeye ayırmak için adım adım bir metodolojiyi tartışıyoruz. Bu prosedürde, erkek fare C57Bl / 6J (6-8 haftalık) beyin çıkarılmasına ve nöroanatomik işaretleri kullanarak birden fazla bölgeye diseksiyonuna odaklandık. Bu çalışma, sinirbilim alanında güçlü bir temel oluşturmaya yardımcı olacak ve beyin fonksiyonunun daha derin anlaşılmasında daha odaklı yaklaşımlara yol açacaktır.
Introduction
Beyin, omurilik ve retina ile birlikte, tüm vücutta uzmanlaşmış, hassas bir şekilde konumlandırılmış ve etkileşime giren hücre tipleri tarafından kontrol edilen karmaşık davranışları yürüten merkezi sinir sistemini içerir1. Beyin, milyarlarca birbirine bağlı nöron ve glia’nın sayısız işlevi yerine getiren hassas devrelere sahip karmaşık bir organdır. İki ayrı lob ve çeşitli hücresel bileşenlere sahip iki taraflı bir yapıdır2. Omurilik beyni dış dünyaya bağlar ve kemik, meninksler ve beyin omurilik sıvısı tarafından korunur ve mesajları beyne yönlendirir 2,3,4. Beynin yüzeyi, serebral korteks, düzensizdir ve gyri adı verilen farklı kıvrımlara ve beyni fonksiyonel merkezlere ayıran sulci adı verilen oluklara sahiptir5. Korteks, küçük bir beyne sahip memelilerde pürüzsüzdür 6,7. Farklı beyin bölgeleriyle ilgili bozuklukları ve fonksiyonel devrelerini anlamak için insan beyninin mimarisini karakterize etmek ve incelemek önemlidir. Sinirbilim araştırmaları son yıllarda genişlemiştir ve beynin yapısını ve işlevini incelemek için çeşitli deneysel yöntemler kullanılmaktadır. Moleküler ve sistem düzeyinde biyoloji alanlarındaki gelişmeler, beyin yapıları ile moleküllerin işleyişi arasındaki karmaşık ilişkiyi araştırmak için yeni bir çağ başlatmıştır. Ek olarak, moleküler biyoloji, genetik ve epigenetik hızla genişlemekte ve sistemlerin nasıl işlediğine dahil olan temel mekanizmalar hakkındaki bilgimizi geliştirmemizi sağlamaktadır. Bu analizler, daha etkili tedavilerin araştırılmasını ve geliştirilmesini hedeflemeye yardımcı olmak için çok daha lokalize bir temelde gerçekleştirilebilir.
Memeli beyni yapısal olarak açıkça tanımlanabilir ayrı bölgelere tanımlanır; Bununla birlikte, bu ayrık yapıların fonksiyonel ve moleküler karmaşıklıkları henüz net olarak anlaşılamamıştır. Beyin dokusunun çok boyutlu ve çok katmanlı doğası, bu manzaranın işlevsel düzeyde incelenmesini zorlaştırmaktadır. Ek olarak, birden fazla fonksiyonun aynı yapı tarafından yerine getirilmesi ve bunun tersi de beynin anlaşılmasını daha da zorlaştırmaktadır8. Beyin bölgelerinin yapısal ve fonksiyonel karakterizasyonu için yürütülen deneysel yaklaşımın, nöroanatomik mimariyi fonksiyonla ilişkilendirmek için örneklemede tutarlılık sağlamak için hassas araştırma metodolojileri kullanması hayati önem taşımaktadır. Beynin karmaşıklığı son zamanlarda, 75 farklıhücre tipinden oluşan insan beyninin temporal girusu gibi 9,10 tek hücreli dizileme kullanılarak açıklanmıştır. Bu verileri fare beyninin benzer bir bölgesinden gelenlerle karşılaştırarak, çalışma sadece mimarilerinde ve hücre tiplerinde benzerlikler ortaya koymakla kalmıyor, aynı zamanda farklılıkları da sunuyor. Bu nedenle, karmaşık mekanizmaları çözmek için, beynin çeşitli bölgelerini tam hassasiyetle incelemek önemlidir. Bir insan ve fare beyni arasındaki korunmuş yapılar ve işlevler, bir farenin insan beyninin işlevini ve davranışsal sonuçlarını aydınlatmak için bir ön vekil olarak kullanılmasını sağlar.
Sistem biyolojisi yaklaşımlarının ilerlemesiyle birlikte, kemirgenlerde ayrık beyin bölgelerinden bilgi elde etmek, sinirbilim araştırmalarında kilit bir prosedür haline gelmiştir. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu12 gibi bazı protokoller pahalı olsa da, mekanik protokoller ucuzdur ve yaygın olarak bulunan araçlar kullanılarak gerçekleştirilir13,14. Transkriptomik tahliller için birden fazla beyin bölgesi kullandık15 ve fare beyninin ilgilendiği bölgeleri kısa sürede adım adım incelemek için uygulamalı ve hızlı bir prosedür geliştirdik. Disseke edildikten sonra, bu dokulardaki nükleik asitleri ve proteinleri korumak için bu numuneler hemen soğuk koşullarda saklanabilir. Yaklaşımımız daha hızlı gerçekleştirilebilir, bu da yüksek verimliliğe yol açar ve doku bozulması için daha az şans sağlar. Bu sonuçta, beyin dokularını kullanarak yüksek kaliteli, tekrarlanabilir deneyler üretme şansını arttırır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Memeli beyni, çeşitli moleküler imzalara ve uzmanlaşmış ve ayrık işlevleri yerine getiren çoklu bölgelere sahip bir dizi morfolojik olarak farklı ve işlevsel olarak benzersiz hücrelerden oluşan karmaşık bir organdır. Burada bildirilen diseksiyon prosedürü, laboratuvarın gereksinimlerine bağlı olarak birden fazla hedefe sahip olabilir. Laboratuvarımızda stres gibi TSSB’ye maruz kalan farelerden toplanan çoklu beyin bölgelerinde transkripsiyonu değerlendirdik16 . Suş gene…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deneysel yardımları için Bayan Seshmalini Srinivasan, Bay Stephen Butler ve Bayan Pamela Spellman’a ve el yazmasını düzenledikleri için Bayan Dana Youssef’e teşekkür ederiz. USAMRDC’nin finansman desteği minnetle kabul edilmektedir. Cenevre Vakfı bu çalışmaya katkıda bulundu ve ABD Ordusu Araştırma Ofisi aracılığıyla Askeri ve Operasyonel Tıp Araştırma Alanı Müdürlüğü III’ten gelen fonlarla desteklendi.
Feragatname:
Materyaller Walter Reed Ordu Araştırma Enstitüsü tarafından gözden geçirilmiştir. Sunumuna ve/veya yayınlanmasına itiraz yoktur. Burada yer alan görüşler veya iddialar yazarın özel görüşleridir ve resmi olarak veya Ordu Bakanlığı veya Savunma Bakanlığı’nın gerçek görüşlerini yansıttığı şeklinde yorumlanmamalıdır. Araştırma, Hayvan Refahı Yasası ve hayvanları içeren hayvanlar ve deneylerle ilgili diğer federal tüzük ve yönetmeliklere uygun olarak AAALAC onaylı bir tesiste onaylanmış bir hayvan kullanım protokolü kapsamında yürütülmüştür ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu, NRC Yayını, 2011 baskısında belirtilen ilkelere uygundur.
Materials
| Brain Removal | |||
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6762 | 5.5" straight sharp/sharp |
| Deaver scissors | Roboz Surgical Store | RS-6763 | 5.5" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6703 | 4.75" curved sharp/sharp |
| Delicate operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6702 | 4.75" straight sharp/sharp |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved Sharp/Sharp |
| Micro spatula, radius and tapered flat ends | stainless steel mirror finish | ||
| Operating scissors 6.5" | Roboz Surgical Store | RS-6846 | curved sharp/sharp |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 | 4.5” 1X2 teeth 2mm tip width |
| Rongeur (optional) | Roboz Surgical Store | RS-8321 many styles to choose | Lempert Rongeur 6.5" 2X8mm |
| Pituitary Dissection | |||
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Super fine forceps Inox | Roboz Surgical Store | RS-4955 | tip size 0.025 X 0.005 mm |
| Brain Dissection | |||
| A magnification visor | Penn Tool Col | 40-178-6 | 2.2x Outer and 3.3x Inner Lens Magnification, Rectangular Magnifier |
| Dissection cold plate | Cellpath.com | JRI-0100-00A | Iceberg cold plate & base |
| Graefe forceps, full curve extra delicate | Roboz Surgical Store | RS-5138 | 0.5 mm Tip 4” (10 cm) long |
| Light operating scissors | Roboz Surgical Store | RS-6753 | 5" curved sharp/sharp |
| Scalpel handle | Roboz Surgical Store | RS-9843 (repeated above) | Scalpel Handle #3 Solid 4" |
| and blades (especially #11) | Roboz Surgical Store | RS-9801-11 (repeated above) | Sterile Scalpel Blades:#11 Box 100 40mm |
| Spatula | Amazon | MS-SQRD9-4 | Double Ended Spatula Square AND Round End |
| Tissue forceps | Roboz Surgical Store | RS-8160 (repeated above) | 4.5” 1X2 teeth |
References
- Zeisel, A., et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Ackerman, S. . Major Structures and Functions of the Brain. 2, (1992).
- P, T. L. S. . StatPearls. , (2019).
- Paramvir, T. L. S. . StatPearls. , (2019).
- Javed, K., Reddy, V., et al. . Neuroanatomy, Cerebral Cortex. , (2020).
- Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neuroscience. 10 (10), 724-735 (2009).
- Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
- Pessoa, L. Understanding brain networks and brain organization. Physics of Life Reviews. 11 (3), 400-435 (2014).
- Mu, Q., Chen, Y., Wang, J. Deciphering Brain Complexity Using Single-cell Sequencing. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 17 (4), 344-366 (2019).
- Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7285-7290 (2015).
- Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Winrow, C. J., et al. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain Research. 1271, 1-17 (2009).
- Atkins, N., Miller, C. M., Owens, J. R., Turek, F. W. Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling. Journal of Visualized Experiments. (57), e3125 (2011).
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Muhie, S., et al. Brain transcriptome profiles in mouse model simulating features of post-traumatic stress disorder. Molecular Brain. 8, 14 (2015).
- Hammamieh, R., et al. Murine model of repeated exposures to conspecific trained aggressors simulates features of post-traumatic stress disorder. Behavioural Brain Research. 235 (1), 55-66 (2012).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 3rd edn. , (2008).
- Franklin, K., Paxinos, G. . The Coronal Plates and Diagrams. , (2019).
- Slotnick, B. M., Leonard, C. M. Stereotaxic atlas of the albino mouse forebrain. Rockville, MD, Alcohol, Drug Abuse and Mental Health Administration, 1975. Annals of Neurology. 10 (4), 403-403 (1981).
- Cajal, S. R., Swanson, N., Swanson, L. W. . Histologie Du Système Nerveux de L’homme Et Des Vertébrés. Anglais. , (1995).
- Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuromethods. 57, 13-26 (2011).
- Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474 (2020).
- Sultan, F. A. Dissection of Different Areas from Mouse Hippocampus. Bio Protocols. 3 (21), (2013).
- Chakraborty, N., et al. Gene and stress history interplay in emergence of PTSD-like features. Behavioural Brain Research. 292, 266-277 (2015).
- Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -. F., Chang, R. C. -. C. Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region. Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).
- Rajmohan, V., Mohandas, E. The limbic system. Indian Journal of Psychiatry. 49 (2), 132-139 (2007).
