Procedure di trapianto di midollo osseo nei topi per studiare l'ematopoiesi clonale

L’ematopoiesi clonale (CH) è una condizione che si osserva frequentemente negli individui anziani e si verifica come risultato di un fusto ematopoietico espanso e di un clone della cellula progenitrice (HSPC) che porta una mutazione genetica¹. È stato suggerito che all’età di 50 anni, la maggior parte degli individui avrà acquisito una media di cinque mutazioni esoniche in ogni HSPC², ma la maggior parte di queste mutazioni comporterà poche o nessuna conseguenza fenotipica per l’individuo. Tuttavia, se per caso una di queste mutazioni conferisce un vantaggio competitivo all’HSPC, ad esempio promuovendone la proliferazione, l’autorinovità, la sopravvivenza o qualche combinazione di queste, ciò potrebbe portare all’espansione preferenziale del clone mutante rispetto agli altri HSPC. Di conseguenza, la mutazione si diffonderà sempre più attraverso il sistema ematopoietico poiché l’HSPC mutato dà origine a cellule del sangue mature, portando a una distinta popolazione di cellule mutate all’interno del sangue periferico. Mentre mutazioni in dozzine di diversi geni driver candidati sono stati associati a eventi clonali all’interno del sistema ematopoietico, tra questi, le mutazioni nel DNA metiltransferasi 3 alfa (DNMT3A) e dieci undici traslocazioni 2 (TET2) sono le più prevalenti³. Diversi studi epidemiologici hanno scoperto che gli individui che portano queste mutazioni genetiche hanno un rischio significativamente più elevato di malattie cardiovascolari (CVD), ictus e mortalità per cause^3,4,5,6,7. Mentre questi studi hanno identificato che esiste un’associazione tra CH e aumento dell’incidenza di CVD e ictus, non sappiamo se questa relazione sia causale o un epifenomeno condiviso con il processo di invecchiamento. Per ottenere una migliore comprensione di questa associazione, sono necessari modelli animali adeguati che ricapitolano correttamente la condizione umana di CH.

Diversi modelli di animali CH sono stati stabiliti dal nostro gruppo e altri utilizzando zebrafish, topi e primati non umani^{8,9,10,11,12,13,14}. Questi modelli utilizzano spesso metodi di ricostituzione ematopoietica mediante trapianto di cellule geneticamente modificate, a volte utilizzando la ricombinazione Cre-lox o il sistema CRISPR. Questo approccio consente l’analisi di una specifica mutazione genica nelle cellule ematopoietiche per valutare come contribuisce allo sviluppo della malattia. Inoltre, questi modelli spesso impiegano cellule congeniche o reporter per distinguere gli effetti delle cellule mutanti dalle cellule normali o di tipo selvaggio. In molti casi, è necessario un regime di precondizione per innestare con successo le cellule staminali ematopoietiche del donatore.

Attualmente, il trapianto di midollo osseo ai topi riceventi può essere diviso in due categorie principali: 1) condizionamento mieloablativo e 2) trapianto non condizionato. Il condizionamento mieloablativo può essere ottenuto con uno dei due metodi seguenti, vale a dire l’irradiazione totale del corpo (TBI) o la chemioterapia¹⁵. Il TBI viene effettuato sottopose il ricevente a una dose letale di irradiazione gamma o a raggi X, generando rotture di DNA o collegamenti incrociati all’interno di cellule che si dividono rapidamente, rendendole^{irreparabili 16}. Busulfan e ciclofosfamide sono due farmaci chemioterapici comunemente usati che interrompono la nicchia ematopoietica e allo stesso modo causano danni al DNA alle cellule che si dividono rapidamente. Il risultato netto della precondizione mieloablativa è l’apoptosi delle cellule ematopoietiche, che distrugge il sistema ematopoietico del ricevente. Questa strategia non solo consente il successo dell’innesto degli HSPC donatori, ma può anche prevenire il rifiuto dell’innesto sopprimendo il sistema immunitario del ricevente. Tuttavia, la precondizione mieloablativa ha gravi effetti collaterali come danni a tessuti e organi e alle loro cellule immunitarie residenti, nonché distruzione della nicchia nativa del midollo osseo¹⁷. Pertanto, sono stati proposti metodi alternativi per superare questi effetti collaterali indesiderati, in particolare per quanto riguarda i danni agli organi di interesse. Questi metodi comprendono l’irradiazione protetta dei topi riceventi e il BMT adottivo per i topi^{non condizionati 9,17}. La protezione del torace, della cavità addominale, della testa o di altre regioni dall’irradiazione mediante il posizionamento di una barriera di piombo protegge i tessuti di interesse dagli effetti dannosi dell’irradiazione e mantiene la loro popolazione di cellule immunitarie residenti. D’altra parte, il BMT adottivo degli HSPC per i topi non condizionati ha un ulteriore vantaggio perché preserva la nicchia ematopoietica nativa. In questo manoscritto, descriviamo i protocolli e i risultati dell’innesto HSPC dopo diversi regimi di trapianto nei topi, in particolare la consegna di HSPC ai topi TBI, ai topi parzialmente schermati dall’irradiazione e ai topi non condizionati. L’obiettivo generale è quello di aiutare i ricercatori a comprendere i diversi effetti fisiologici di ogni metodo e come influenzano i risultati sperimentali nella definizione di CH e malattie cardiovascolari.