Summary

ניתוח כמותי למחצה של פפטידוגליקן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה וביואינפורמטיקה

Published: October 13, 2020
doi:

Summary

פרוטוקול זה מכסה ניתוח מפורט של הרכב פפטידוגליקן באמצעות ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם מיצוי תכונות מתקדם ותוכנת ניתוח ביואינפורמטיקה.

Abstract

פפטידוגליקן הוא מרכיב חשוב בדפנות תאי החיידקים ומטרה תאית נפוצה לאנטי-מיקרוביאליים. למרות שהיבטים של מבנה פפטידוגליקן נשמרים למדי בכל החיידקים, קיימת גם שונות ניכרת בין גראם-חיוביים/שליליים ובין מינים. בנוסף, ידועים מספר רב של וריאציות, שינויים או התאמות לפפטידוגליקן שיכולים להתרחש בתוך מין חיידקים בתגובה לשלב הגדילה ו / או גירויים סביבתיים. וריאציות אלה מייצרות מבנה דינמי מאוד הידוע כמשתתף בתפקודים תאיים רבים, כולל גדילה/חלוקה, עמידות לאנטיביוטיקה והימנעות מהגנת המאכסן. כדי להבין את השונות בתוך הפפטידוגליקן, יש לפרק את המבנה הכולל לחלקים המרכיבים אותו (המכונים מורופפטידים) ולהעריך את ההרכב התאי הכולל. Peptidoglycomics משתמשת בספקטרומטריית מסות מתקדמת בשילוב עם ניתוח נתונים ביואינפורמטי רב עוצמה כדי לבחון את הרכב הפפטידוגליקן בפירוט רב. הפרוטוקול הבא מתאר את טיהור הפפטידוגליקן מתרביות חיידקים, רכישת נתוני עוצמת מורופפטיד באמצעות כרומטוגרף נוזלי – ספקטרומטר מסות, וניתוח דיפרנציאלי של הרכב הפפטידוגליקן באמצעות ביואינפורמטיקה.

Introduction

פפטידוגליקן (PG) הוא מאפיין מגדיר של חיידקים המשמש לשמירה על המורפולוגיה של התא, תוך מתן תמיכה מבנית לחלבונים ולרכיבים תאיים אחרים 1,2. עמוד השדרה של PG מורכב מחומצה מורמית N-אצטיל מקושרת β-1,4 לסירוגין (MurNAc) ו-N-אצטיל גלוקוזאמין (GlcNAc)1,2. לכל MurNAc יש פפטיד קצר הקשור בשאריות ᴅ-lactyl שניתן להצליב לפפטידים סמוכים המקושרים לדו-סוכר (איור 1A,B). ההצלבה הזו מייצרת מבנה דמוי רשת שמקיף את כל התא, ולעתים קרובות מתייחסים אליו כאל עצם העצה (איור 1C). במהלך סינתזת PG, קודמנים נוצרים בציטופלסמה, ומועברים על פני הממברנה הציטופלזמית על ידי פליפסות. מבשרי משולבים לאחר מכן לתוך PG בוגר על ידי אנזימים transglycosylase ו transpeptidase, אשר מייצרים את הקשרים glycosidic ו peptide, בהתאמה3. עם זאת, לאחר הרכבתם, ישנם אנזימים רבים המיוצרים על ידי החיידקים שמשנים ו/או מפרקים את PG כדי לבצע מספר תהליכים תאיים, כולל גדילה וחלוקה. נוסף על כך, הודגם כי שינויים שונים של PG מעניקים התאמות ספציפיות למתח, לתנאי גדילה וללחץ סביבתי, אשר היו מעורבים באיתות תאי, עמידות אנטי-מיקרוביאלית והתחמקות ממערכת החיסון של המארח4. לדוגמה, שינוי נפוץ הוא הוספת קבוצת אצטיל C6 על MurNAc המקנה עמידות על ידי הגבלת הגישה לקישורי גליקן β-1,4 לאנזימי ליזוזים המיוצרים על ידי המאכסן אשר מפרקים PG 4,5,6. באנטרוקוקסי, החלפה של הטרמינל ᴅ-Ala של שרשרת הצד הפפטידית ב-ᴅ-Lac מעניקה עמידות גדולה יותר לאנטי-מיקרוביאלית, ונקומיצין 7,8.

הנוהל הכללי לבידוד וטיהור PG נותר כמעט ללא שינוי מאז תואר בשנות השישים9. קרומי חיידקים מומסים באמצעות טיפול בחום עם SDS, ולאחר מכן הסרה אנזימטית של חלבונים קשורים, גליקוליפידים ושאריות DNA. לאחר מכן ניתן לעכל את העצה השלמה המטוהרת לרכיבים בודדים על ידי הידרוליזה של קישור β-1,4 בין GlcNAc ו- MurNAc. העיכול הזה מייצר מפרקים של GlcNAc-MurNAc עם כל שינוי מבני ו/או קישורים צולבים שלמים, והם נקראים מורופפטידים (איור 1B).

ניתוח הרכב של PG בוצע בתחילה באמצעות הפרדה כרומטוגרפית נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) כדי לטהר כל מורופפטיד ואחריו זיהוי ידני של מורופפטידים10,11. זה הוחלף מאז על ידי כרומטוגרפיה נוזלית טנדם ספקטרומטריית מסה (LC-MS), אשר מגביר את רגישות הגילוי ומקטין את עומס העבודה הידנית של טיהור כל muropeptide בודד. עם זאת, האופי הגוזל זמן ומורכב של זיהוי ידני של muropeptides נשאר גורם מגביל, הפחתת מספר המחקרים שנערכו. בשנים האחרונות עם הופעתן של טכנולוגיות “אומיות”, מיצוי תכונות LC-MS אוטומטי הפך לכלי רב עוצמה, המאפשר זיהוי וזיהוי מהיר של תרכובות בודדות בדגימות מורכבות ממערכי נתונים גדולים מאוד. לאחר זיהוי התכונות, תוכנה ביואינפורמטית משווה סטטיסטית את השונות בין הדגימות באמצעות ניתוח דיפרנציאלי המבודד אפילו הבדלים מינימליים בין מערך הנתונים המורכב ומציג אותם באופן גרפי למשתמש. היישום של תוכנת חילוץ תכונות לניתוח הרכב PG רק החל להיחקר 12,13,14 ומשולב לניתוח ביואינפורמטי 12. בניגוד לאנליזה פרוטאומית הנהנה ממאגרי החלבונים הזמינים המנבאים פיצול פפטידים המאפשר זיהוי אוטומטי לחלוטין, לא קיימת כיום ספריית פיצול עבור פפטידוגליקומיקס. עם זאת, מיצוי תכונות יכול להיות משולב עם מסדי נתונים מבניים ידועים וחזויים כדי לחזות זיהוי muropeptide12. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשימוש במיצוי תכונות מבוסס LC-MS בשילוב עם ספריית מורופפטיד לזיהוי אוטומטי וניתוח דיפרנציאלי ביואינפורמטי של הרכב PG (איור 2).

Protocol

1. הכנת מדגם Peptidoglycan גידול תרביות חיידקיםהערה: גדילת תרביות החיידקים תשתנה בהתאם לזן החיידקים ולתנאי הגידול הנבדקים. הפרמטרים הניסיוניים שייבדקו יגדירו את תנאי הגידול.גידול תרביות חיידקים בתנאי גידול הנדרשים לזן החיידק ולתכנון הניסוי. לגדל חיידקים כתרביות משולשות (ה…

Representative Results

רגישות זיהוי מוגברת של מכונות טרשת נפוצה בשילוב עם תוכנת זיהוי שיא רבת עוצמה שיפרו את היכולת לבודד, לנטר ולנתח הרכבי חומרים של דגימות מורכבות בפירוט דק מאוד. באמצעות התקדמות טכנולוגית זו, מחקרים אחרונים על הרכב פפטידוגליקן החלו להשתמש בטכניקות מיצוי תכונות LC-MS אוטומטיות 12,13,14,24 על פני מתוד…

Discussion

פרוטוקול זה מתאר שיטה לטיהור פפטידוגליקן מתרביות חיידקים, תהליך לזיהוי LC-MS וניתוח הרכב באמצעות טכניקות ביואינפורמטיקה. כאן, אנו מתמקדים בחיידקים גראם-שליליים ויידרש שינוי קל כדי לאפשר ניתוח של חיידקים גראם-חיוביים.

הכנת muropeptides נשאר כמעט זהה מאז שהוא הופק לראשונה בשנת 1960 9,11…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות לד”ר ג’ניפר גדס-מקאליסטר ולד”ר אנתוני קלארק על תרומתם בשכלול פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי תפעול מ- CIHR שהוענקו ל- C.M.K (PJT 156111) ו- NSERC אלכסנדר גרהם בל CGS D שהוענק ל- E.M.A. הנתונים נוצרו ב- BioRender.com.

Materials

Equipment
C18 reverse phase column – AdvanceBio Peptide column (100 mm x 2.1 mm 2.7 µm) Agilent LC-MS data acquisition
Heating mantle controller, Optichem Fisher 50-401-788 for 4% SDS boil
Heating Mantle, 1000mL Hemispherical Fisher CG1000008 for 4% SDS boil
Incubator, 37°C for sacculi purification and MS sample prep
Leibig condenser, 300MM 24/40, Fisher CG121805 for 4% SDS boil
Lyophilizer Labconco for lyophilization of sacculi
Magentic stirrer Fisher 90-691-18 for 4% SDS boil
mass spectrometer Q-Tof model UHD 6530 Aglient LC-MS data acquisition
microcentrifuge filters, Nanosep MF 0.2 µm Fisher 50-197-9573 cleanup of sample before MS injection
Retort stand Fisher 12-000-102 for 4% SDS boil
Retort clamp Fisher S02629 for 4% SDS boil
round bottom flask – 1 liter pyrex Fisher 07-250-084 for 4% SDS boil
Sonicator model 120 Fisher FB120 for sacculi purification
Sonicator – micro tip Fisher FB4422 for sacculi purification
Ultracentrifuge Beckman sacculi wash steps
Ultracentrifuge bottles, Ti45 Fisher NC9691797 sacculi wash steps
Water supply City for water cooled condenser
Software
Chemdraw Cambridgesoft molecular editor for muropeptide fragmentation prediction
Excel Microsoft viewing lists of annotated muropeptides, abundance, isotopic patterns, etc.
MassHunter Acquisition Aglient running QTOF instrument
MassHunter Mass Profiler Professional Aglient bioinformatic differential analysis
MassHunter Personal Compound Database and Library Manager Aglient muropeptide m/z MS database
MassHunter Profinder Aglient recursive feature extraction
MassHunter Qualitative analysis Aglient viewing MS and MS/MS chromatograms
Prism Graphpad Graphing software
Perseus Max Plank Institute of Biochemistry 1D annotation
Material
Acetonitrile Fisher A998-4
Ammonium acetate Fisher A637
Amylase Sigma-Aldrich A6380
Boric acid Fisher BP168-1
DNase Fisher EN0521
Formic acid Sigma-Aldrich 27001-500ML-R
LC-MS tuning mix – HP0321 Agilent G1969-85000
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M8266
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506
Mutanolysin from Streptomyces globisporus ATCC 21553 Sigma-Aldrich M9901
Nitrogen gas (>99% purity) Praxair NI 5.0UH-T
Phosphoric acid Fisher A242
Pronase E from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147
RNase Fisher EN0531
Sodium azide Fisher S0489
Sodium borohydride Sigma-Aldrich 452890
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166
Sodium hydroxide Fisher S318
Sodium Phosphate (dibasic) Fisher S373
Sodium Phosphate (monobasic) Fisher S369
Stains-all Sigma-Aldrich E9379

References

  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Reviews. 32, 149-167 (2007).
  2. Pazos, M., Peters, K. Peptidoglycan. Sub-cellular Biochemistry. 92, 127-168 (2019).
  3. Typas, A., Banzhaf, M., Gross, C. A., Vollmer, W. From the regulation of peptidoglycan synthesis to bacterial growth and morphology. Nature Reviews. Microbiology. 10 (2), 123-136 (2011).
  4. Yadav, A. K., Espaillat, A., Cava, F. Bacterial strategies to preserve cell wall integrity against environmental threats. Frontiers in Microbiology. 9, 2064 (2018).
  5. Bera, A., Herbert, S., Jakob, A., Vollmer, W., Götz, F. Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus. Molecular Microbiology. 55 (3), 778-787 (2005).
  6. Brott, A. S., Clarke, A. J. Peptidoglycan O-acetylation as a virulence factor: its effect on lysozyme in the innate immune system. Antibiotics. 8 (3), 94 (2019).
  7. Putty, S., Vemula, H., Bobba, S., Gutheil, W. G. A liquid chromatography-tandem mass spectrometry assay for D-Ala-D-Lac: A key intermediate for vancomycin resistance in vancomycin-resistant Enterococci. Analytical Biochemistry. 442 (2), 166-171 (2013).
  8. Arthur, M., et al. Evidence for in vivo incorporation of D-lactate into peptidoglycan precursors of vancomycin-resistant Enterococci. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 36 (4), 867-869 (1992).
  9. Mardarowicz, C. Isolierung und Charakterisierung des Murein-Sacculus von Brucella. Z. Naturforsdig. 21, 1006-1007 (1966).
  10. Glauner, B., Höltje, J. V., Schwarz, U. The composition of the murein of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 263 (21), 10088-10095 (1988).
  11. Glauner, B. Separation and quantification of muropeptides with high-performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 172, 451-464 (1988).
  12. Anderson, E. M., et al. Peptidoglycomics reveals compositional changes in peptidoglycan between biofilm- and planktonic-derived Pseudomonas aeruginosa. The Journal of Biological Chemistry. 295 (2), 504-516 (2020).
  13. van der Aart, L. T., et al. High-resolution analysis of the peptidoglycan composition in Streptomyces coelicolor. Journal of Bacteriology. 200 (20), 00290 (2018).
  14. Bern, M., Beniston, R., Mesnage, S. Towards an automated analysis of bacterial peptidoglycan structure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409, 551-560 (2017).
  15. Brott, A. S., Sychantha, D., Clarke, A. J. Assays for the enzymes catalyzing the O-acetylation of bacterial cell wall polysaccharides. Methods in Molecular Biology. 1954, 115-136 (2019).
  16. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  17. Rusconi, F., Douard Valton, &. #. 2. 0. 1. ;., Nguyen, R., Dufourc, E. Quantification of sodium dodecyl sulfate in microliter-volume biochemical samples by visible light spectroscopy. Analytical Biochemistry. 295, 31-37 (2001).
  18. Verwer, R. W. H., Beachey, E. H., Keck, W., Stoub, A. M., Poldermans, J. E. Oriented fragmentation of Escherichia coli sacculi by sonication. Journal of Bacteriology. 141 (1), 327-332 (1980).
  19. Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society: Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
  20. Article, R., Alonso, A., Marsal, S., Julià, A., James Carroll, A. Analytical methods in untargeted metabolomics: state of the art in 2015. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 23 (2015).
  21. Xi, B., Gu, H., Baniasadi, H., Raftery, D. Statistical analysis and modeling of mass spectrometry-based metabolomics data. Methods in Molecular Biology. 1198, 333-353 (2014).
  22. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  23. Cox, J., Mann, M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data. BMC Bioinformatics. 13, 12 (2012).
  24. Chang, J. D., Foster, E. E., Thadani, A. N., Ramirez, A. J., Kim, S. J. Inhibition of Staphylococcus aureus cell wall biosynthesis by desleucyl-oritavancin: A quantitative peptidoglycan composition analysis by mass spectrometry. Journal of Bacteriology. 199 (15), 00278 (2017).
  25. Glauner, B., Höltje, J. V. Growth pattern of the murein sacculus of Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 265 (31), 18988-18996 (1990).
  26. Espaillat, A., et al. Chemometric analysis of bacterial peptidoglycan reveals atypical modifications that empower the cell wall against predatory enzymes and fly innate immunity. Journal of the American Chemical Society. 138 (29), 9193-9204 (2016).
  27. Quintela, J. C., Caparros, M., de Pedro, M. A. Variability of peptidoglycan structural parameters in Gram-negative bacteria. FEMS Microbiology Letters. 125, 95-100 (1995).
  28. Quintela, J. C., Zollner, P., Portillo, F. G., Allmaier, G., de Pedro, M. A. Cell wall structural divergence among Thermus spp. FEMS Microbiology Letters. 172, 223-229 (1999).
  29. Torrens, G., et al. Comparative analysis of peptidoglycans from Pseudomonas aeruginosa isolates recovered from chronic and acute infections. Frontiers in Microbiology. 10, 0868 (2019).
  30. Antignac, A., et al. Detailed structural analysis of the peptidoglycan of the human pathogen Neisseria meningitidis. The Journal of Biological Chemistry. 278 (34), 31521-31528 (2003).
  31. De Jonges, B. L. M., Changi, Y. S., Gage, D., Tomaszs, A. Peptidoglycan composition of a highly methicillin-resistant Staphylococcus aureus strain. The role of penicillin binding protein 2A. The Journal of Biological Chemistry. 267 (16), 11248-11264 (1992).
  32. Lee, M., et al. Muropeptides in Pseudomonas aeruginosa and their role as elicitors of β-lactam-antibiotic resistance. Angewandte Chemie – International Edition. 55, 6882-6886 (2016).
  33. Schumann, P. Peptidoglycan Structure. Methods in Microbiology. 38, 101-129 (2011).
  34. Wientjes, F. B., Woldringh, C. L., Nanninga, N. Amount of peptidoglycan in cell walls of Gram-negative bacteria. Journal of Bacteriology. 173 (23), 7684-7691 (1991).

Play Video

Cite This Article
Anderson, E. M., Greenwood, N. A., Brewer, D., Khursigara, C. M. Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics. J. Vis. Exp. (164), e61799, doi:10.3791/61799 (2020).

View Video