Semi-quantitative Analyse von Peptidoglycan mittels Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie und Bioinformatik

Peptidoglycan (PG) ist ein charakteristisches Merkmal von Bakterien, das dazu dient, die Zellmorphologie aufrechtzuerhalten und gleichzeitig Proteine und andere zelluläre Komponenten strukturell zu unterstützen ^1,2. Das Rückgrat von PG besteht aus abwechselnd β-1,4-verknüpfter N-Acetyl-Muraminsäure (MurNAc) und N-Acetylglucosamin (GlcNAc)^1,2. Jedes MurNAc besitzt ein kurzes Peptid, das am ᴅ-Lactylrest gebunden ist und mit benachbarten disaccharidgebundenen Peptiden vernetzt werden kann (Abbildung 1A,B). Durch diese Vernetzung entsteht eine netzartige Struktur, die die gesamte Zelle umfasst und oft als Sacculus bezeichnet wird (Abbildung 1C). Während der PG-Synthese werden Vorläufer im Zytoplasma erzeugt und durch Flippasen durch die zytoplasmatische Membran transportiert. Vorläufer werden anschließend durch Transglykosylase- und Transpeptidase-Enzyme, die die glykosidischen bzw. Peptidbindungen produzieren, in das reife PG eingebaut³. Einmal zusammengesetzt, gibt es jedoch zahlreiche Enzyme, die von den Bakterien produziert werden, die das PG modifizieren und/oder abbauen, um eine Reihe von zellulären Prozessen durchzuführen, einschließlich Wachstum und Teilung. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass verschiedene Modifikationen des PG anpassungsspezifische Anpassungen an den Stamm, die Wachstumsbedingungen und den Umweltstress verleihen, die mit der Zellsignalisierung, der antimikrobiellen Resistenz und der Immunevasion des Wirts in Verbindung gebracht wurden⁴. Eine häufige Modifikation ist beispielsweise die Hinzufügung einer C6-Acetylgruppe an das MurNAc, die Resistenz verleiht, indem sie den Zugang zu den Glykan-β-1,4-Bindungen an vom Wirt produzierte Lysozymenzyme einschränkt, die PG ^4,5,6 abbauen. Bei Enterokokken verleiht die Substitution des terminalen ᴅ-Ala der Peptidseitenkette durch ᴅ-Lac eine größere Resistenz gegen das antimikrobielle Vancomycin ^7,8.

Das allgemeine Verfahren zur PG-Isolierung und -Reinigung ist seit seiner Beschreibung in den 1960er Jahren relativ unverändert^{geblieben 9}. Bakterielle Membranen werden durch Wärmebehandlung mit SDS aufgelöst, gefolgt von enzymatischer Entfernung von gebundenen Proteinen, Glykolipiden und verbleibender DNA. Der gereinigte intakte Sacculus kann anschließend durch Hydrolyse der β-1,4-Bindung zwischen GlcNAc und MurNAc in die einzelnen Bestandteile aufgeschlossen werden. Dieser Aufschluss produziert GlcNAc-MurNAc-Disaccharide mit intakten strukturellen Modifikationen und/oder Vernetzungen, die als Muropeptide bezeichnet werden (Abbildung 1B).

Die Analyse der Zusammensetzung von PG wurde zunächst durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie-Trennung (HPLC) durchgeführt, um jedes Murropeptid zu reinigen, gefolgt von einer manuellen Identifizierung von Muropeptiden^10,11. Dies wurde inzwischen durch die Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS) abgelöst, die die Nachweisempfindlichkeit erhöht und den manuellen Arbeitsaufwand für die Reinigung jedes einzelnen Murropeptids verringert. Die zeitaufwändige und komplexe Natur der manuellen Identifizierung von Muropeptiden ist jedoch ein limitierender Faktor geblieben, der die Anzahl der durchgeführten Studien reduziert. In den letzten Jahren hat sich mit dem Aufkommen von “omic”-Technologien die automatisierte LC-MS-Merkmalsextraktion zu einem leistungsstarken Werkzeug entwickelt, das eine schnelle Erkennung und Identifizierung einzelner Verbindungen in komplexen Proben aus sehr großen Datensätzen ermöglicht. Sobald die Merkmale identifiziert sind, vergleicht die bioinformatische Software statistisch die Variation zwischen den Proben mithilfe der Differentialanalyse, isoliert selbst minimale Unterschiede zwischen dem komplexen Datensatz und zeigt sie dem Benutzer grafisch an. Die Anwendung von Merkmalsextraktionssoftware für die Analyse der PG-Zusammensetzung wurde gerade erst erforscht 12,13,14 und mit der bioinformatischen Analyse ¹² gekoppelt. Im Gegensatz zur Proteomik-Analyse, die von den leicht verfügbaren Proteindatenbanken profitiert, die die Peptidfragmentierung vorhersagen und eine vollautomatische Identifizierung ermöglichen, gibt es derzeit keine Fragmentierungsbibliothek für Peptidoglykomics. Die Merkmalsextraktion kann jedoch mit bekannten und vorhergesagten Strukturdatenbanken gekoppelt werden, um die Identifizierung von Murropeptid¹² vorherzusagen. Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Verwendung der LC-MS-basierten Merkmalsextraktion in Kombination mit einer Murropeptidbibliothek zur automatisierten Identifizierung und bioinformatischen Differentialanalyse der PG-Zusammensetzung vor (Abbildung 2).