マウス腹腔内脂肪貯蔵所からの脂肪形成性および線維炎症性間質細胞亜集団の単離
Summary
このプロトコルは、蛍光活性化細胞選別または免疫磁気ビーズ分離により、マウス腹腔内白色脂肪組織(WAT)デポから脂肪形成および線維炎症性間質細胞亜集団を単離するための技術的アプローチを説明しています。
Abstract
白色脂肪組織(WAT)の間質血管画分(SVF)は、非常に不均一であり、成人期のWATの拡張とリモデリングに機能的に寄与する多数の細胞タイプで構成されています。この細胞の不均一性の影響を研究する上での大きな障壁は、in vitroおよびin vivo分析のためにWAT SVFから機能的に異なる細胞亜集団を容易に分離できないことです。シングルセルシーケンシング技術は最近、成体マウスの腹腔内WATデポにおいて、機能的に異なる線維炎症性および脂肪形成性PDGFRβ+血管周囲細胞亜集団を同定しました。線維炎症性前駆細胞(「FIP」と呼ばれる)は、炎症誘発性の表現型を発揮できる非脂肪原性コラーゲン産生細胞です。PDGFRβ+脂肪細胞前駆細胞(APC)は、細胞移植時にin vitroおよびin vivoの両方で高い脂肪形成を示します。ここでは、マウスの腹腔内WATデポからこれらの間質細胞亜集団を単離するための複数の方法について説明します。FIPおよびAPCは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)またはビオチン化抗体ベースの免疫磁気ビーズ技術を利用することにより、単離できます。単離された細胞は、分子解析や機能解析に利用することができます。間質細胞亜集団の機能特性を単独で研究することで、細胞レベルでの生理学的または病理学的条件下での脂肪組織リモデリングに関する現在の知識が広がります。
Introduction
白色脂肪組織(WAT)は、哺乳類のエネルギー貯蔵の主要な部位を表しています。この組織内では、脂肪細胞、または「脂肪細胞」が過剰なカロリーをトリグリセリドの形で貯蔵し、大きな単房性脂肪滴にパッケージ化されています。さらに、脂肪細胞は、エネルギー恒常性の様々な側面を調節する多数の因子を分泌する1,2,3。脂肪細胞はWATボリュームの大部分を占めています。ただし、脂肪細胞はWAT 4,5に見られる全細胞の50%未満しか占めていません。WATの非脂肪細胞コンパートメント、または間質血管画分(SVF)は、非常に不均一であり、血管内皮細胞、組織常在免疫細胞、線維芽細胞、および脂肪細胞前駆細胞(APC)集団が含まれています。
WATは、エネルギー貯蔵の需要の増加に伴ってサイズを拡大するという驚くべき能力において、非常に優れています。WATでの脂質の適切な保存は、非脂肪組織への有害な異所性脂質沈着から保護するため、この組織の可塑性を維持することが不可欠です6。カロリー過剰に反応して個々のWATデポがこの拡大を経験する方法は、肥満の状況におけるインスリン感受性の重要な決定要因です7。メタボリックシンドロームの肥満患者に観察される病理学的WAT拡張は、代謝的に好ましい皮下脂肪組織を犠牲にして、内臓WATデポの優先的な拡大によって特徴付けられます。さらに、肥満におけるインスリン抵抗性は、WATの病理学的リモデリングに関連しています。これは、既存の脂肪細胞の肥大成長(サイズの増加)、不十分な血管新生、慢性代謝炎症、細胞外マトリックス成分の蓄積(線維化)、および組織の低酸素症によって特徴付けられます8,9。これらの肥満のWAT表現型は、脂肪異栄養症(機能的WATの欠如)の状態で観察されるものと同様に、脂肪肝およびインスリン抵抗性と関連しています。対照的に、健康なWATの拡大は代謝的に健康な肥満集団で観察され、脂肪細胞過形成10を介した保護皮下WATおよびデポー拡大の優先的な拡大によって特徴付けられます。新しい脂肪細胞の動員は、脂肪細胞前駆細胞(APC)からのde novo脂肪細胞の分化(「脂肪形成」と呼ばれる)によって媒介されます。脂肪細胞の過形成は、比較的低い程度のWAT線維症および代謝性炎症と一致します6,11。WAT微小環境内の多数の細胞型は、肥満におけるWATの健康と拡張性に直接影響します12。そのため、WATに存在するさまざまな細胞タイプの機能を定義することは、この分野にとって依然として高い優先事項です。
過去10年間で、ヒトおよびマウスのWAT SVF13から天然APCを定義し、単離するためにいくつかの戦略が採用されてきました。このような戦略では、抗体ベースの細胞分離技術を用いて、一般的な間葉系幹細胞/前駆細胞マーカーの細胞表面発現に基づいてAPCを単離します。これらのアプローチには、蛍光標識抗体を用いた蛍光活性化細胞選別(FACS)や、免疫磁気ビーズ分離(すなわち、化学的に修飾された抗体)が含まれます。APCの単離を標的とする細胞表面タンパク質には、PDGFRα、PDGFRβ、CD34、およびSCA-1が含まれます。これらのアプローチは、APCの充実に役立っています。しかし、これらのマーカーに基づいて単離された細胞集団は、かなり不均一です。ごく最近のシングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)研究では、マウスWAT 14,15,16,17の単離された間質血管画分(SVF)内の間質細胞の分子的および機能的不均一性が浮き彫りになっています。私たち自身のscRNA-seqおよび機能解析から、成体マウスの腹腔内WATの間質コンパートメントにおける機能的に異なる免疫調節および脂肪形成PDGFRβ+血管周囲細胞亜集団を同定し、特徴付けました15。線維炎症性前駆体(FIP)は、PDGFRβ+細胞の顕著な亜集団であり、LY6C発現(LY6C+ PDGFRβ+細胞)に基づいて単離することができる15。FIPは脂肪形成能力を欠き、さまざまな刺激に対して強い炎症誘発性反応を発揮し、コラーゲンを生成し、抗脂肪生成因子を分泌します15。これらの細胞の炎症誘発性および線維形成活性は、マウスの肥満に関連して増加し、これらの細胞がWATリモデリングの調節因子として関与しています。LY6C- CD9- PDGFRβ+亜集団は、脂肪細胞前駆細胞(APC)を表します。これらのAPCは、Ppargおよび他の脂肪形成促進遺伝子の発現に富んでおり、in vitroおよびin vivoで成熟脂肪細胞に容易に分化します15。ここでは、FACSを使用して成体マウスの腹腔内WATデポからこれらの異なる細胞集団を単離し、ビオチン化抗体を使用して免疫磁気ビーズを分離するための詳細なプロトコルを提供します。このプロトコルは、成体雄および雌マウスの複数の腹腔内WATデポから機能的に異なる脂肪前駆細胞亜集団を単離するために使用することができる15。これらの機能的に異なる細胞集団を単独で研究することは、健康と疾患における脂肪形成と腹腔内脂肪組織のリモデリングを調節する分子メカニズムの現在の理解に大きく貢献する可能性があります。
以下のプロトコルは、マウス精巣上体WATからの脂肪前駆細胞の単離を詳述しています。しかし、同じ手順を使用して、雄および雌マウス15の両方の腸間膜および後腹膜WATデポから対応する細胞を単離することができる。マウスでこれらのデポを同定し、単離する方法に関する詳細なプロトコルは、Bagchi et al.18に記載されています。このプロトコルは、6〜8週齢のマウスの使用に最適化されています。APCの頻度と分化能力は、加齢に伴って低下する可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
マウスのC57BL/6系統は、食事誘発性肥満の研究で最も使用されているマウス系統です。C57BL/6マウスは、高脂肪食(HFD)を摂取すると急速に体重が増加し、肥満に関連するメタボリックシンドロームの顕著な特徴(インスリン抵抗性や高脂血症など)を発現します。特に、高脂肪食(HFD)の摂食に関連して起こるWATの拡大は、デポ特異的な方法で起こる19,20,21,22,23。<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、優れた技術支援を提供してくれたLisa HansenとKirsten Vestergaard、そして原稿の批判的な読み方をしてくれたP. Scherer、N. Joffin、C. Creweに感謝しています。著者らは、ここで説明するプロトコルの開発における優れたガイダンスと支援を提供してくれたUTSW Flow Cytometry Coreに感謝します。R.K.G. は、NIH NIDDK R01 DK104789、NIDDK RC2 DK118620、および NIDDK R01 DK119163 でサポートされています。J.P.は、Innovation Fund Denmarkから博士課程前賞を受賞しています。
Materials
| Mechanical Tissue Preparation and SVF Isolation | |||
| 40 and 100 µm cell strainers | Fisher Scientific | 352340/352360 | |
| 1X Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 21040CV | |
| 5ml polypropylene tubes | Fisher Scientific | 352053 | |
| Digestion Buffer (for 10mL) | |||
| 10 ml HBSS | Sigma | H8264 | |
| 10 mg Collagenase D (1 mg/ml final cc.) | Roche | 11088882001 | |
| 0.15 g BSA (1.5 % final cc.) | Fisher Scientific | BP1605-100 | |
| Immunomagnetic separation of APCs and non-APCs | |||
| 5X MojoSort Buffer (MS buffer) | BioLegend | 480017 | |
| 5 ml MojoSort Magnet (MS magnet) | BioLegend | 480019 | |
| 100 µL MojoSort Streptavidin Nanobeads | BioLegend | 480015 | |
| Purity Check and FACS | |||
| 10X Red Blood Cell Lysis Buffer | eBioscience | 00-4300-54 | |
| Fc block (Mouse CD16/CD32) | eBioscience | 553141 | |
| Antibodies | |||
| Biotin CD45 | BioLegend | 103103 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: 30-F11 |
| Biotin CD31 | BioLegend | 102503 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: MEC13.3 |
| Biotin CD9 | BioLegend | 124803 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: MZ3 |
| Biotin LY6C | BioLegend | 128003 | Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells Species: Mouse Clone: HK1.4 |
| CD31-PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 102419 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: 390 |
| CD45-PerCP/Cy5.5 | BioLegend | 103131 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: 30-F11 |
| CD140b PDGFRβ-PE | BioLegend | 136006 | Concentration: Dilution 1:50 Species: Mouse Clone: APB5 |
| LY6C-APC | BioLegend | 128016 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: HK1.4 |
| CD9-FITC | BioLegend | 124808 | Concentration: Dilution 1:400 Species: Mouse Clone: MZ3 |
| Cell Culture and Differentiation | |||
| Gonadal APC Culture media (for 500mL) | |||
| 288 mL DMEM with 1 g/L glucose | Corning | 10-014-CV | |
| 192 mL MCDB201 | Sigma | M6770 | |
| 10 mL Fetal bovine serum (FBS)** lot#14E024 | Sigma | 12303C | |
| 5 mL 100% ITS premix | BD Bioscience | 354352 | |
| 5 mL 10 mM L-ascorbic acid-2-2phosphate | Sigma | A8960-5G | |
| 50 µL 100 g/ml FGF-basic | R&D systems | 3139-FB-025/CF | |
| 5 mL Pen/Strep | Corning | 30-001-CI | |
| 500 µL Gentamycin | Gibco | 15750-060 | |
| **NOTE: The adipogenic capacity of primary APCs can vary from lot to lot of commercial FBS. Multiple lots/sources of FBS should be tested. |
References
- Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (2), 85-97 (2011).
- Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
- Funcke, J. B., Scherer, P. E. Beyond adiponectin and leptin: adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication. Journal of Lipid Research. 60 (10), 1648-1684 (2019).
- Eto, H., et al. Characterization of structure and cellular components of aspirated and excised adipose tissue. Plastic and Reconstructive Surgery. 124 (4), 1087-1097 (2009).
- Hirsch, J., Batchelor, B. Adipose tissue cellularity in human obesity. Clinics in Endocrinology and Metabolism. 5 (2), 299-311 (1976).
- Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).
- Hepler, C., Gupta, R. K. The expanding problem of adipose depot remodeling and postnatal adipocyte progenitor recruitment. Molecular Cell Endocrinology. 445, 95-108 (2017).
- Jo, J., et al. Hypertrophy and/or Hyperplasia: Dynamics of Adipose Tissue Growth. PLoS Computational Biology. 5 (3), 1000324 (2009).
- Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2094-2101 (2011).
- Kloting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Vishvanath, L., Gupta, R. K. Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4022-4031 (2019).
- Choe, S. S., Huh, J. Y., Hwang, I. J., Kim, J. I., Kim, J. B. Adipose Tissue Remodeling: Its Role in Energy Metabolism and Metabolic Disorders. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 30 (2016).
- Hepler, C., Vishvanath, L., Gupta, R. K. Sorting out adipocyte precursors and their role in physiology and disease. Genes and Development. 31 (2), 127-140 (2017).
- Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28 (2), 300-309 (2018).
- Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. Elife. 7, 39636 (2018).
- Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364 (6438), 2501 (2019).
- Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559 (7712), 103-108 (2018).
- Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
- Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nature Cell Biology. 17 (4), 376-385 (2015).
- Kim, S. M., et al. Loss of white adipose hyperplastic potential is associated with enhanced susceptibility to insulin resistance. Cell Metabolism. 20 (6), 1049-1058 (2014).
- Vishvanath, L., et al. Pdgfrbeta+ Mural Preadipocytes Contribute to Adipocyte Hyperplasia Induced by High-Fat-Diet Feeding and Prolonged Cold Exposure in Adult Mice. Cell Metabolism. 23 (2), 350-359 (2016).
- Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
- Gao, Z., Daquinag, A. C., Su, F., Snyder, B., Kolonin, M. G. PDGFRalpha/PDGFRbeta signaling balance modulates progenitor cell differentiation into white and beige adipocytes. Development. 145 (1), 155861 (2018).
- Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
- Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
- Buffolo, M., et al. Identification of a Paracrine Signaling Mechanism Linking CD34(high) Progenitors to the Regulation of Visceral Fat Expansion and Remodeling. Cell Reports. 29 (2), 270-282 (2019).
- Shao, M., et al. De novo adipocyte differentiation from Pdgfrbeta(+) preadipocytes protects against pathologic visceral adipose expansion in obesity. Nature Communications. 9 (1), 890 (2018).
- Lee, P. Y., Wang, J. X., Parisini, E., Dascher, C. C., Nigrovic, P. A. Ly6 family proteins in neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 585-594 (2013).
- Vijay, J., et al. Single-cell analysis of human adipose tissue identifies depot and disease specific cell types. Nature Metabolism. 2 (1), 97-109 (2020).
