Summary

从小鼠腹内脂肪库分离成脂肪和纤维炎症基质细胞亚群

Published: August 16, 2020
doi:

Summary

该协议描述了通过荧光激活细胞分选或免疫磁珠分离从小鼠腹内白色脂肪组织(WAT)库中分离脂肪生成和纤维炎基质细胞亚群的技术方法。

Abstract

白色脂肪组织 (WAT) 的基质-血管部分 (SVF) 具有显着的异质性,由多种细胞类型组成,这些细胞类型在功能上有助于成年期 WAT 的扩增和重塑。研究这种细胞异质性的影响的一个巨大障碍是无法轻易地从 WAT SVF 中分离出功能不同的细胞亚群以进行体外和体内分析。单细胞测序技术最近在成年小鼠腹内WAT库中鉴定出功能不同的纤维炎和成脂PDGFRβ+血管周围细胞亚群。纤维炎祖细胞(称为“FIP”)是非脂肪生成胶原蛋白产生细胞,可以发挥促炎表型。PDGFRβ+ 脂肪细胞前体细胞 (APC) 在细胞移植后在体外和体内都具有高度脂肪生成性。在这里,我们描述了从小鼠腹内 WAT 仓库中分离这些基质细胞亚群的多种方法。FIP 和 APC 可以通过荧光激活细胞分选 (FACS) 或利用基于生物素化抗体的免疫磁珠技术进行分离。分离的细胞可用于分子和功能分析。孤立地研究基质细胞亚群的功能特性将扩展我们目前在细胞水平的生理或病理条件下脂肪组织重塑的知识。

Introduction

白色脂肪组织(WAT)是哺乳动物储存能量的主要场所。在这种组织中,脂肪细胞或“脂肪细胞”以甘油三酯的形式储存多余的卡路里,这些卡路里被包装成大的单房脂滴。此外,脂肪细胞分泌多种因子来调节能量稳态的各个方面 1,2,3。脂肪细胞占WAT体积的大部分;然而,脂肪细胞仅占 WAT 4,5 中发现的总细胞的不到 50%。WAT 的非脂肪细胞区室或基质血管部分 (SVF) 具有相当异质性,包含血管内皮细胞、组织驻留免疫细胞、成纤维细胞和脂肪细胞前体细胞 (APC) 群体。

随着对储能需求的增加,WAT具有出色的扩展能力。保持这种组织可塑性至关重要,因为在 WAT 中充分储存脂质可以防止有害的异位脂质沉积到非脂肪组织中6.在肥胖的情况下,各个 WAT 仓库因热量过剩而进行这种扩张的方式是胰岛素敏感性的关键决定因素7.在患有代谢综合征的肥胖个体中观察到的病理性 WAT 扩张,其特征是内脏 WAT 库优先扩张,而牺牲代谢有利的皮下脂肪组织。此外,肥胖症中的胰岛素抵抗与 WAT 的病理重塑有关。其特征是现有脂肪细胞的肥大生长(尺寸增加),血管生成不足,慢性代谢炎症,细胞外基质成分(纤维化)的积累和组织缺氧8,9。这些肥胖的 WAT 表型与肝脂肪变性和胰岛素抵抗有关,类似于在脂肪营养不良(缺乏功能性 WAT)条件下观察到的情况。相比之下,在代谢健康的肥胖人群中观察到健康的 WAT 扩张,其特征是保护性皮下 WAT 的优先扩张和通过脂肪细胞增生的仓库扩张10。新脂肪细胞的募集是通过从脂肪细胞前体细胞 (APC) 中新头分化脂肪细胞介导的(称为“脂肪生成”)。脂肪细胞增生与相对较低程度的 WAT 纤维化和代谢炎症相吻合 6,11。WAT 微环境中的多种细胞类型直接影响 WAT 在肥胖中的健康和可扩展性12.因此,定义WAT中存在的各种细胞类型的功能仍然是该领域的重中之重。

在过去的十年中,已经采用了几种策略来定义和分离来自人和小鼠 WAT SVF13 的天然 APC。这些策略使用基于抗体的细胞分离技术,根据常见间充质干细胞/祖细胞标志物的细胞表面表达分离 APC。这些方法包括使用荧光团标记抗体的荧光激活细胞分选 (FACS) 或免疫磁珠分离(即化学修饰的抗体)。靶向分离 APC 的细胞表面蛋白包括 PDGFRα、PDGFRβ、CD34 和 SCA-1。这些方法有助于丰富APC;然而,基于这些标记物分离的细胞群具有相当大的异质性。最近的单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 研究强调了小鼠 WAT 14,15,16,17 分离的基质-血管部分 (SVF) 内基质细胞的分子和功能异质性。根据我们自己的 scRNA-seq 和功能分析,我们已经鉴定并表征了成年小鼠腹内 WAT 基质区室中功能不同的免疫调节和成脂 PDGFRβ+ 血管周围细胞亚群15。纤维炎症前体 (FIP) 是 PDGFRβ+ 细胞的重要亚群,可以根据 LY6C 表达(LY6C+ PDGFRβ+ 细胞)15 进行分离。FIPs缺乏成脂能力,对各种刺激产生强烈的促炎反应,产生胶原蛋白,并分泌抗脂肪生成因子15。这些细胞的促炎和纤维化活性与小鼠肥胖有关而增加,表明这些细胞是WAT重塑的调节因子。LY6C-CD9-PDGFRβ+ 亚群代表脂肪细胞前体细胞 (APC)。这些 APC 富含 Pparg 和其他促脂肪基因的表达,并且在体外和体内很容易分化成成熟的脂肪细胞15。在这里,我们提供了一个详细的方案,用于使用FACS从成年小鼠的腹内WAT库中分离这些不同的细胞群,并使用生物素化抗体进行免疫磁珠分离。该协议可用于从成年雄性和雌性小鼠的多个腹内WAT库中分离功能不同的脂肪祖细胞亚群15。单独研究这些功能不同的细胞群可能极大地有助于我们目前对健康和疾病中调节脂肪生成和腹内脂肪组织重塑的分子机制的理解。

以下方案详细介绍了从小鼠附睾WAT中分离脂肪祖细胞的方法;然而,相同的程序可用于从雄性和雌性小鼠的肠系膜和腹膜后 WAT 库中分离相应的细胞15。关于如何在小鼠中识别和分离这些仓库的详细方案可以在Bagchi等人18中找到。该协议已针对6-8周龄的小鼠的使用进行了优化。APCs的频率和分化能力可能随着年龄的增长而下降。

Protocol

所有动物协议和程序均已获得德克萨斯大学西南医学中心机构动物使用和护理委员会的批准。 1. 从性腺白色脂肪组织中分离基质血管分数 (SVF) 解剖来自6-8周龄小鼠的性腺白色脂肪组织,并将脂肪垫置于1x PBS溶液中。 结合多达 4 个脂肪库(推荐 1-2 只小鼠的 2-4 个脂肪库),并在含有 200 μL 消化缓冲液(1x HBSS,1.5% BSA 和 1 mg/mL 胶原酶 D)的 10 mL 烧杯中切碎组?…

Representative Results

该协议描述了两种策略,允许从成年小鼠的腹内WAT仓库中分离不同的基质细胞群。APC和FIP可以通过FACS(图1)或使用生物素化抗体(图2)分离免疫磁珠来分离。这两种方法都利用了市售的试剂和抗体。免疫磁珠分离可从 gWAT SVF 中分离出成脂细胞和非成脂细胞。流式细胞术分析显示,成脂部分内75%的细胞代表LY6C-CD9-APCs。>75% 的非成脂部?…

Discussion

小鼠C57BL / 6品系是饮食诱导的肥胖研究中使用最多的小鼠品系。C57BL/6小鼠在高脂肪饮食(HFD)时体重迅速增加,并出现与肥胖相关的代谢综合征的一些突出特征(例如,胰岛素抵抗和高脂血症)。值得注意的是,与高脂肪饮食 (HFD) 喂养相关的 WAT 扩增以仓库特异性方式发生 19,20,21,22,23。<su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

作者感谢 Lisa Hansen 和 Kirsten Vestergaard 提供的出色技术援助,以及 P. Scherer、N. Joffin 和 C. Crewe 对手稿的批判性阅读。作者感谢UTSW流式细胞术核心在制定本文所述方案方面提供的出色指导和帮助。R.K.G. 受 NIH NIDDK R01 DK104789、NIDDK RC2 DK118620 和 NIDDK R01 DK119163 支持。J.P.由丹麦创新基金的博士前奖赞助。

Materials

Mechanical Tissue Preparation and SVF Isolation
40 and 100 µm cell strainers Fisher Scientific 352340/352360
1X Phosphate buffered saline (PBS) Fisher Scientific 21040CV
5ml polypropylene tubes Fisher Scientific 352053
Digestion Buffer (for 10mL)
10 ml HBSS Sigma H8264
10 mg Collagenase D (1 mg/ml final cc.) Roche 11088882001
0.15 g BSA (1.5 % final cc.) Fisher Scientific BP1605-100
Immunomagnetic separation of APCs and non-APCs
5X MojoSort Buffer (MS buffer) BioLegend 480017
5 ml MojoSort Magnet (MS magnet) BioLegend 480019
100 µL MojoSort Streptavidin Nanobeads BioLegend 480015
Purity Check and FACS
10X Red Blood Cell Lysis Buffer eBioscience 00-4300-54
Fc block (Mouse CD16/CD32) eBioscience 553141
Antibodies
Biotin CD45 BioLegend 103103 Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: 30-F11
Biotin CD31 BioLegend 102503 Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: MEC13.3
Biotin CD9 BioLegend 124803 Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: MZ3
Biotin LY6C BioLegend 128003 Concentration: ≤ 0.25 µg per 10^6 cells
Species: Mouse
Clone: HK1.4
CD31-PerCP/Cy5.5 BioLegend 102419 Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: 390
CD45-PerCP/Cy5.5 BioLegend 103131 Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: 30-F11
CD140b PDGFRβ-PE BioLegend 136006 Concentration: Dilution 1:50
Species: Mouse
Clone: APB5
LY6C-APC BioLegend 128016 Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: HK1.4
CD9-FITC BioLegend 124808 Concentration: Dilution 1:400
Species: Mouse
Clone: MZ3
Cell Culture and Differentiation
Gonadal APC Culture media (for 500mL)
288 mL DMEM with 1 g/L glucose Corning 10-014-CV
192 mL MCDB201 Sigma M6770
10 mL Fetal bovine serum (FBS)** lot#14E024 Sigma 12303C
5 mL 100% ITS premix BD Bioscience 354352
5 mL 10 mM L-ascorbic acid-2-2phosphate Sigma A8960-5G
50 µL 100 g/ml FGF-basic R&D systems 3139-FB-025/CF
5 mL Pen/Strep Corning 30-001-CI
500 µL Gentamycin Gibco 15750-060
**NOTE: The adipogenic capacity of primary APCs can vary from lot to lot of commercial FBS. Multiple lots/sources of FBS should be tested.

References

  1. Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nature Reviews Immunology. 11 (2), 85-97 (2011).
  2. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  3. Funcke, J. B., Scherer, P. E. Beyond adiponectin and leptin: adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication. Journal of Lipid Research. 60 (10), 1648-1684 (2019).
  4. Eto, H., et al. Characterization of structure and cellular components of aspirated and excised adipose tissue. Plastic and Reconstructive Surgery. 124 (4), 1087-1097 (2009).
  5. Hirsch, J., Batchelor, B. Adipose tissue cellularity in human obesity. Clinics in Endocrinology and Metabolism. 5 (2), 299-311 (1976).
  6. Ghaben, A. L., Scherer, P. E. Adipogenesis and metabolic health. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (4), 242-258 (2019).
  7. Hepler, C., Gupta, R. K. The expanding problem of adipose depot remodeling and postnatal adipocyte progenitor recruitment. Molecular Cell Endocrinology. 445, 95-108 (2017).
  8. Jo, J., et al. Hypertrophy and/or Hyperplasia: Dynamics of Adipose Tissue Growth. PLoS Computational Biology. 5 (3), 1000324 (2009).
  9. Sun, K., Kusminski, C. M., Scherer, P. E. Adipose tissue remodeling and obesity. Journal of Clinical Investigation. 121 (6), 2094-2101 (2011).
  10. Kloting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
  11. Vishvanath, L., Gupta, R. K. Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity. Journal of Clinical Investigation. 129 (10), 4022-4031 (2019).
  12. Choe, S. S., Huh, J. Y., Hwang, I. J., Kim, J. I., Kim, J. B. Adipose Tissue Remodeling: Its Role in Energy Metabolism and Metabolic Disorders. Frontiers in Endocrinology (Lausanne). 7, 30 (2016).
  13. Hepler, C., Vishvanath, L., Gupta, R. K. Sorting out adipocyte precursors and their role in physiology and disease. Genes and Development. 31 (2), 127-140 (2017).
  14. Burl, R. B., et al. Deconstructing Adipogenesis Induced by beta3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metabolism. 28 (2), 300-309 (2018).
  15. Hepler, C., et al. Identification of functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic stromal subpopulations in visceral adipose tissue of adult mice. Elife. 7, 39636 (2018).
  16. Merrick, D., et al. Identification of a mesenchymal progenitor cell hierarchy in adipose tissue. Science. 364 (6438), 2501 (2019).
  17. Schwalie, P. C., et al. A stromal cell population that inhibits adipogenesis in mammalian fat depots. Nature. 559 (7712), 103-108 (2018).
  18. Bagchi, D. P., MacDougald, O. A. Identification and Dissection of Diverse Mouse Adipose Depots. Journal of Visualized Experiments. (149), e59499 (2019).
  19. Jeffery, E., Church, C. D., Holtrup, B., Colman, L., Rodeheffer, M. S. Rapid depot-specific activation of adipocyte precursor cells at the onset of obesity. Nature Cell Biology. 17 (4), 376-385 (2015).
  20. Kim, S. M., et al. Loss of white adipose hyperplastic potential is associated with enhanced susceptibility to insulin resistance. Cell Metabolism. 20 (6), 1049-1058 (2014).
  21. Vishvanath, L., et al. Pdgfrbeta+ Mural Preadipocytes Contribute to Adipocyte Hyperplasia Induced by High-Fat-Diet Feeding and Prolonged Cold Exposure in Adult Mice. Cell Metabolism. 23 (2), 350-359 (2016).
  22. Wang, Q. A., Tao, C., Gupta, R. K., Scherer, P. E. Tracking adipogenesis during white adipose tissue development, expansion and regeneration. Nature Medicine. 19 (10), 1338-1344 (2013).
  23. Gao, Z., Daquinag, A. C., Su, F., Snyder, B., Kolonin, M. G. PDGFRalpha/PDGFRbeta signaling balance modulates progenitor cell differentiation into white and beige adipocytes. Development. 145 (1), 155861 (2018).
  24. Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo. Cell. 135 (2), 240-249 (2008).
  25. Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. Isolation and study of adipocyte precursors. Methods Enzymol. 537, 31-46 (2014).
  26. Buffolo, M., et al. Identification of a Paracrine Signaling Mechanism Linking CD34(high) Progenitors to the Regulation of Visceral Fat Expansion and Remodeling. Cell Reports. 29 (2), 270-282 (2019).
  27. Shao, M., et al. De novo adipocyte differentiation from Pdgfrbeta(+) preadipocytes protects against pathologic visceral adipose expansion in obesity. Nature Communications. 9 (1), 890 (2018).
  28. Lee, P. Y., Wang, J. X., Parisini, E., Dascher, C. C., Nigrovic, P. A. Ly6 family proteins in neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 585-594 (2013).
  29. Vijay, J., et al. Single-cell analysis of human adipose tissue identifies depot and disease specific cell types. Nature Metabolism. 2 (1), 97-109 (2020).

Play Video

Cite This Article
Peics, J., Vishvanath, L., Zhang, Q., Shan, B., Pedersen, T. Å., Gupta, R. K. Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots. J. Vis. Exp. (162), e61610, doi:10.3791/61610 (2020).

View Video