Isolatie van adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties uit intra-abdominale vetdepots van muizen

Wit vetweefsel (WAT) vertegenwoordigt de belangrijkste plaats voor energieopslag bij zoogdieren. In dit weefsel slaan adipocyten, of ‘vetcellen’, overtollige calorieën op in de vorm van triglyceriden, verpakt in grote uniloculaire lipidedruppels. Bovendien scheiden adipocyten een groot aantal factoren af die verschillende aspecten van energiehomeostase reguleren ^1,2,3. Adipocyten vormen het grootste deel van het WAT-volume; adipocyten vertegenwoordigen echter slechts minder dan 50% van het totale aantal cellen dat wordt aangetroffen in WAT ^4,5. Het niet-adipocytencompartiment van WAT, of stromale-vasculaire fractie (SVF), is vrij heterogeen en bevat vasculaire endotheelcellen, weefsel-residente immuuncellen, fibroblasten en populaties van adipocytenprecursorcellen (APC).

WAT is uitzonderlijk in zijn opmerkelijke vermogen om in omvang uit te breiden naarmate de vraag naar energieopslag toeneemt. Het handhaven van deze weefselplasticiteit is essentieel, aangezien een adequate opslag van lipiden in WAT beschermt tegen schadelijke ectopische lipideafzetting in niet-vetweefsels⁶. De manier waarop individuele WAT-depots deze expansie ondergaan als reactie op een calorieoverschot is een cruciale bepalende factor voor insulinegevoeligheid in de setting van obesitas⁷. Pathologische WAT-expansie, waargenomen bij zwaarlijvige personen met metabool syndroom, wordt gekenmerkt door preferentiële expansie van viscerale WAT-depots ten koste van metabolisch gunstig onderhuids vetweefsel. Bovendien wordt insulineresistentie bij obesitas in verband gebracht met pathologische remodellering van WAT. Dit wordt gekenmerkt door hypertrofische groei van bestaande adipocyten (toename in omvang), ontoereikende angiogenese, chronische metabole ontsteking, accumulatie van extracellulaire matrixcomponenten (fibrose) en weefselhypoxie ^8,9. Deze WAT-fenotypes van obesitas worden geassocieerd met leversteatose en insulineresistentie, vergelijkbaar met wat wordt waargenomen bij de aandoening van lipodystrofie (afwezigheid van functionele WAT). Daarentegen wordt gezonde WAT-expansie waargenomen in de metabolisch gezonde zwaarlijvige populatie en wordt gekenmerkt door preferentiële expansie van beschermende subcutane WAT en depot-expansie door adipocytenhyperplasie¹⁰. De rekrutering van nieuwe adipocyten wordt gemedieerd door de novo differentiatie van adipocyten uit adipocytenprecursorcellen (APC’s) (“adipogenese” genoemd). Hyperplasie van adipocyten valt samen met relatief lagere graden van WAT-fibrose en metabole ontsteking ^6,11. Een veelheid aan celtypen binnen de WAT-micro-omgeving heeft een directe invloed op de gezondheid en uitbreidbaarheid van WAT bij obesitas¹². Als zodanig blijft het definiëren van de functie van de verschillende celtypen die aanwezig zijn in WAT een hoge prioriteit voor het veld.

In het afgelopen decennium zijn verschillende strategieën gebruikt om inheemse APC’s te definiëren en te isoleren van menselijke en muizen WAT SVF¹³. Dergelijke strategieën isoleren APC’s op basis van de expressie van het celoppervlak van gemeenschappelijke mesenchymale stam-/voorlopercelmarkers met behulp van op antilichamen gebaseerde celscheidingstechnieken. Deze benaderingen omvatten fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), met behulp van fluorofoor-gelabelde antilichamen, of immunomagnetische parelscheiding (d.w.z. chemisch gemodificeerde antilichamen). Celoppervlakte-eiwitten die het doelwit zijn van de isolatie van APC’s zijn PDGFRα, PDGFRβ, CD34 en SCA-1. Deze benaderingen hebben bijgedragen aan de verrijking van APC’s; Celpopulaties geïsoleerd op basis van deze markers zijn echter vrij heterogeen. Zeer recente single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) studies hebben de moleculaire en functionele heterogeniteit van stromale cellen binnen de geïsoleerde stromale-vasculaire fractie (SVF) van muizen WAT 14,15,16,17 aan het licht gebracht. Op basis van onze eigen scRNA-seq en functionele analyses hebben we functioneel verschillende immuunmodulerende en adipogene PDGFRβ+ perivasculaire celsubpopulaties geïdentificeerd en gekarakteriseerd in het stromale compartiment van intra-abdominaal WAT bij volwassen muizen¹⁵. Fibro-inflammatoire precursoren, of FIP’s, vertegenwoordigen een prominente subpopulatie van PDGFRβ+-cellen en kunnen worden geïsoleerd op basis van LY6C-expressie (LY6C+ PDGFRβ+-cellen)¹⁵. FIP’s missen adipogene capaciteit, oefenen een sterke pro-inflammatoire reactie uit op verschillende stimuli, produceren collageen en scheiden anti-adipogene factoren^{af 15}. De pro-inflammatoire en fibrogene activiteit van deze cellen neemt toe in verband met obesitas bij muizen, wat impliceert dat deze cellen reguleren van WAT-remodellering. De LY6C-CD9-PDGFRβ+-subpopulatie vertegenwoordigt adipocytenprecursorcellen (APC’s). Deze APC’s zijn verrijkt door de expressie van Pparg en andere pro-adipogene genen, en differentiëren gemakkelijk tot rijpe adipocyten in vitro en in vivo¹⁵. Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor de isolatie van deze verschillende celpopulaties uit intra-abdominale WAT-depots van volwassen muizen met behulp van FACS, en immunomagnetische parelscheiding met gebiotinyleerde antilichamen. Dit protocol kan worden gebruikt om functioneel verschillende subpopulaties van vetvoorlopercellen te isoleren van meerdere intra-abdominale WAT-depots van volwassen mannelijke en vrouwelijke muizen¹⁵. Het afzonderlijk bestuderen van deze functioneel verschillende celpopulaties kan een grote bijdrage leveren aan ons huidige begrip van de moleculaire mechanismen die adipogenese en de remodellering van intra-abdominaal vetweefsel bij gezondheid en ziekte reguleren.

Het onderstaande protocol beschrijft de isolatie van vetvoorlopercellen van muizen epididymale WAT; dezelfde procedure kan echter worden gebruikt om overeenkomstige cellen te isoleren uit de mesenteriale en retroperitoneale WAT-depots van zowel mannelijke als vrouwelijke muizen¹⁵. Een gedetailleerd protocol over hoe deze depots bij muizen te identificeren en te isoleren is te vinden in Bagchi et ^al.18. Dit protocol is geoptimaliseerd voor het gebruik van muizen van 6-8 weken oud. De frequentie en het differentiatievermogen van APC’s kunnen afnemen in verband met veroudering.