Ridurre al minimo l'ipossia nelle fette di ippocampale da topi adulti e anziani

L’avvento dei preparati a fette cerebrali acute dei mammiferi ha facilitato esperimenti a livello cellulare e sinaptico che in precedenza erano possibili solo in preparazioni invertebrate come Aplysia¹. Lo sviluppo di fette acute di ippocampo era di particolare importanza, in quanto è una struttura responsabile della memoria di lavoro e della formazione del contesto, e ha un circuito tri-sinaptico specializzato che è su misura per una facile manipolazione fisiologica. Tuttavia, la stragrande maggioranza delle fette cerebrali acute sono ancora preparate da topi e ratti relativamente giovani, in quanto è più facile preservare neuroni e circuiti sani e le fette rimangono vitali per lunghi periodi^{di tempo 2,3,4}. Qui, introduciamo modifiche ai protocolli di sezionamento standard che si traducono in una maggiore vitalità delle fette acute di ippocampo da topi adulti e invecchiati.

Il principale ostacolo alla vitalità ex vivo a lungo termine del parenchyma cerebrale dei mammiferi è il danno ipossico iniziale che si verifica rapidamente una volta che il flusso sanguigno al cervello smette di essere decapitato. La perdita di ossigeno si traduce in un rapido consumo metabolico di grandi risorse energetiche nel cervello con la perdita di fosfo-creatina (P-creatine) essendo il più rapido, seguito da glucosio, adenosina triphosphate (ATP), e glicogeno⁴. La conservazione dell’ATP è di particolare importanza per la salute a lungo termine delle fette cerebrali, in quanto l’ATP è necessario per mantenere il potenziale della membrana tramite l’ATPase Na-K, e di conseguenza l’attività neurale^5,6. Il livello ATP nel cervello dei roditori adulti è di 2,5 mM, e scende precipitosamente entro 20 s di decapitazione per raggiungere uno stato stabile basale (0,5 mM) a circa 1 min dopo la^{decapitazione 4,7,8}. Negli animali giovani, ci vuole più tempo per osservare lo stesso calo dell’ATP (2 min); con anestesia fenobarbitale è ulteriormente rallentato a 4 min⁴. Queste considerazioni dimostrano che prevenire la perdita di ATP e altre risorse energetiche è una strategia necessaria per prevenire danni ipossici al cervello e a sua volta per mantenere la salute delle fette cerebrali per lunghi periodi di tempo, soprattutto negli animali adulti.

Le basse temperature rallentano il metabolismo. Di conseguenza, è stato dimostrato che una modesta ipotermia protegge le riserve di energia cerebrale: negli animali giovani, abbassando la temperatura corporea di sei gradi, da 37 gradi centigradi a 31 gradi centigradi, mantiene i livelli di ATP a circa l’80% dei livelli normali oltre i 4 h di ipossia^{controllata 9}. I livelli di P-creatina sono conservati allo stesso modo, così come il potenziale di fosforilazione complessiva⁹. Ciò suggerisce che abbassare la temperatura corporea prima della decapitazione potrebbe essere neuroprotettivo, come quasi normale livelli di ATP potrebbero essere mantenuti attraverso il taglio fetta e slice periodi di recupero.

Nella misura in cui un calo ATP non può essere completamente impedito al momento della decapitazione, si prevede una funzione parzialmente compromessa del Na-K ATPase, seguita dalla depolarizzazione tramite afflusso passivo di sodio. Poiché l’afflusso passivo di sodio è seguito dall’ingresso di acqua nelle cellule, provoca edema citotossico e infine pyknosis. Nei ratti adulti, la sostituzione degli ioni di Naè con il saccarosio nelle soluzioni di taglio delle fette è stata una strategia di successo per alleviare il peso dell’edema citotossico^10,11. Più di recente, le cations organiche metilate che riducono la permeabilità del canale di sodio¹² hanno dimostrato di offrire una protezione più efficace rispetto al saccarosio, soprattutto nelle fette di topi adulti, con N-methyl-D-glucamina (NMDG) più ampiamente applicabile tra diverse età e regioni del cervello^13,14,15,16.

Numerosi protocolli di taglio del cervello prevedono l’utilizzo di temperature fredde solo durante la fase di taglio delle fette, a volte in combinazione^con la strategia di sostituzione degli ioni^{Na 16,17}. Nei giovani animali, questi protocolli sembrano offrire sufficiente neuroprotezione poiché il cervello può essere estratto rapidamente dopo la decapitazione perché il cranio è ancora sottile e facile da rimuovere³. Tuttavia, questa strategia non produce fette sane da animali adulti. Nel corso del tempo, un certo numero di laboratori che studiano roditori adulti hanno introdotto la perfusione transcardiale con una soluzione ghiacciata per diminuire la temperatura corporea dell’animale, e quindi danni ipossici al cervello, prima della decapitazione. Questa procedura è stata applicata con successo per produrre fette cerebellari¹⁸, fette midbrain¹⁹, fette neocorticali^11,20, corteccia perirhinale²¹, ippocampo di ratto^10,22,23, bulbo olfattivo²⁴, ventrala stritatum²⁵, corteccia visiva²⁶.

Nonostante i vantaggi offerti dalla perfusione transcarriale e dalla sostituzione degli ioni na^– nella preparazione di fette di ratto e in alcune regioni cerebrali nei topi, l’ippocampo dei topi rimane una delle aree più impegnative da proteggere dall’ipossia^13,20. Ad oggi, uno degli approcci più comuni per affettare l’ippocampo da topi e modelli murini di invecchiamento della neurodegenerazione comporta il classico affettatura veloce dell’ippocampo^{isolato 27}. Nel protocollo qui descritto, riduciamo al minimo la perdita di ATP nel cervello adulto introducendo l’ipotermia prima della decapitazione mediante la decifrazione dell’animale con^na– liquido cerebrospinale artificiale a base di NMDG (NMDG-aCSF) gratuito. Le fette vengono poi tagliate⁺in NMDG-aCSF senza ghiaccio. Con questo protocollo avanzato otteniamo fette acute di ippocampo da topi adulti e di invecchiamento che sono sani fino a 10 h dopo il sezionamento e sono appropriati per le registrazioni sul campo a lungo termine e gli studi di patch-clamp.