从成人和老化小鼠的河马切片中尽量减少低氧

哺乳动物急性脑切片制剂的出现促进了细胞和突触水平的实验，这些实验以前只能在无脊椎动物制剂（如Aplysia^{1）中实现}。急性海马切片的发展具有特殊意义，因为它是一种负责工作记忆和上下文形成的结构，并且具有一种专门的三突触电路，易于生理操作。然而，绝大多数急性脑片仍然由相对年轻的小鼠和大鼠组成，因为它更容易保存健康的神经元和回路，而且这些切片在较长时间^{2、3、43期间仍然存活}。²在这里，我们引入对标准切片协议的修改，提高成年和老化小鼠急性海马切片的生存能力。

哺乳动物大脑白症的长期外生力的主要障碍是，一旦血液在斩首后停止流向大脑，就迅速发生最初的缺氧损伤。缺氧导致大脑中主要能量资源的快速代谢消耗，磷肌酸（P-肌酸）损失速度最快，其次是葡萄糖、三磷酸腺苷（ATP）和糖原^4。保存ATP对于大脑切片的长期健康特别重要，因为ATP需要通过Na-K ATPase保持膜电位，从而维持^{神经活动5，6。,6}成年啮齿动物大脑中的ATP水平为±2.5 mM，在斩首后约1分钟、7、8时，在斩首后20秒内急剧下降，达到基底稳定状态（±0.5 mM）。^4,7,8在幼年动物中，观察ATP相同下降需要更长的时间（±2分钟）;与苯巴比他麻醉，它进一步放缓到4分钟^4。这些考虑表明，防止ATP和其他能量资源的丧失是防止大脑缺氧损伤的必要策略，反过来又可以长期维持大脑切片的健康，特别是在成年动物中。

低温减慢新陈代谢。因此，已经证明适度的体温过低可以保护大脑能量储备：在幼年动物中，将体温从37°C降低6度至31°C，将ATP水平控制在4小时以上的控制缺氧9中，将ATP水平控制在正常水平^的80%左右。P-肌酸水平同样保留，以及整体磷酸化电位^9。这表明，在斩首前降低体温可能是神经保护，因为ATP的接近正常水平可以通过切片切割和切片恢复期保持。

由于在斩首时无法完全防止ATP下降，预计Na-K ATPase的功能会部分受损，然后通过被动钠流入去极化。由于被动钠的涌入后，水进入细胞，它导致细胞毒性水肿，并最终皮刀病。在成年大鼠中，用蔗糖代替蔗糖是减轻细胞毒性水肿^10、11,负担^{的成功策略}。最近，减少钠通道渗透^性12的甲基化有机化合物已经证明比蔗糖提供更有效的保护，特别是在成年小鼠的切片中，N-甲基-D-葡萄糖^,胺（NMDG）在不同年龄和大脑区域^,13、14、15、16中^13,14应用^得最广泛。¹⁵

许多大脑切片方案涉及仅在切片切割步骤期间使用低温，有时与 Na⁺离子替换策略^{16，,17 相结合}。在幼年动物中，这些协议似乎提供了足够的神经保护，因为大脑可以在斩首后迅速提取，因为头骨仍然薄，易于切除^3。然而，这种策略并不能从成年动物身上产生健康的切片。随着时间的推移，一些研究成年啮齿动物的实验室已经引进了转心灌注与冰冷的溶液，以降低动物的体温，因此在斩首之前对大脑的缺氧损伤。该程序被成功地应用于产生小脑片^18，中脑切片^19，新皮质切片11，20，腹皮层^11,2021，大鼠海马^体10，22，23，嗅球^24，腹状盘^{,22,23状体25，}视觉^皮层26。

尽管跨心灌注和^Na+离子替代在准备大鼠切片和小鼠某些大脑区域提供了优势，但小鼠海马仍然是保护^13，20,缺氧的最具挑战性的区域^之一。迄今为止，从老化的小鼠和神经退化的小鼠模型中切分海马体的最常见方法之一涉及分离的海马²⁷的经典快速切片。在此描述的协议中，我们通过将脱毛前引入体温过低，通过用冰冷的 Na⁺– 基于 NMDG 的免费人工脑脊髓液 （NMDG） 来将动物转行，从而最大限度地减少成人大脑中 ATP 的损失。然后切成冰片在冰冷的 Na^{+ 无}Nmdg – acsf。通过这种增强的协议，我们从成年和老化的小鼠获得急性海马切片，切片后健康长达10小时，适合长期现场记录和贴片夹研究。