Système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène pour l’analyse d’interaction protéine-protéine de membrane

Les interactions protéine-protéine (IPP) jouent un rôle central tout au long de la biologie, depuis le maintien de la structure et de la fonction des protéines jusqu’à la régulation de systèmes entiers. Les IPP se sous de nombreuses formes différentes peuvent être classés en fonction des types d’interactions qu’ils forment. L’une de ces catégorisations est homooligomérique ou hétérooligomérique, selon que les interactions sont entre des sous-unités identiques ou différentes protéines agissant sous-units. Une autre catégorisation est basée sur la force de l’interaction si les interactions conduit à la formation de complexes stables ou d’états complexes transitoires. L’information structurelle sur les IPP entre les protéines est cruciale pour comprendre le mécanisme par lequel les protéines effectuent leur fonction. On estime que plus de 80 % des protéines reposent sur une formation complexe pour s’acquitter de leurs rôles fonctionnels¹. Étant donné le pourcentage de protéines observées comme dépendant des IPP pour un bon fonctionnement inné, leur importance en biologie est évidente, mais être en mesure d’étudier correctement les protéines qui s’engagent dans ces interactions est resté difficile en raison des limitations dans les techniques disponibles pour observer expérimentalement lorsque les protéines forment des IPP.

Il y a un degré élevé de désaccord entre les résultats pour beaucoup d’IPP expérimentalement déterminés en raison de la quantité élevée de bruit, de faux positifs, et de faux négatifs qui sont dérivés de beaucoup des techniques de détermination actuellement disponibles de PPI. C’est particulièrement le cas pour le système de levure à deux hybrides (Y2H), la spectrométrie de purification de masse d’affinité en tandem (TAP-MS) et le transfert d’énergie par résonance fluorescence (FRET), qui représentent trois des méthodes les plus couramment utilisées pour la détermination PPI^2,3,4,5,6,7. En comparaison, les techniques de biologie structurale protéique, telles que la résonance magnétique nucléaire (RM), la cristallographie aux rayons X et la microscopie électronique (EM), peuvent être utilisées pour obtenir des informations structurelles à haute résolution sur les interactions protéine-protéine jusqu’au niveau atomique et permettre la confirmation visuelle directe des interactions se produisant pour une protéine cible d’intérêt. Toutes les techniques de recherche non fondées sur la structure actuellement disponibles (p. ex., Y2H, TAP-MS et FRET) n’ont pas cette capacité et souffrent en outre de la difficulté à identifier les interactions faibles et transitoires entre les protéines⁵. Ces lacunes sont encore améliorées lors de l’étude des protéines membranaires en raison de la complexité supplémentaire provoquée par la variable supplémentaire de l’environnement lipidique qui influence la formation d’une structure quaternaire appropriée et d’un assemblage complexe hétéromérique.

Les protéines membranaires composent une grande partie du protéome et sont connues pour jouer de nombreux rôles cruciaux dans le bon fonctionnement cellulaire dans tous les organismes vivants. Malgré le fait que les protéines membranaires représentent 27 % du génome humain et constituent environ 60 % de toutes les cibles actuelles en matière de^{médicaments,}il existe une anomalie majeure dans le nombre de modèles résolus pour les protéines membranaires qui ne représentent que ~2,2 % de toutes les structures^{protéiques publiées 8},^9,10. La principale cause de l’écart dans la disponibilité de l’information structurelle réside dans les propriétés intrinsèques des protéines membranaires elles-mêmes. En raison de leur faible solubilité, de leur dépendance à l’égard des interactions avec un environnement lipidique pour maintenir la structure et la fonction indigènes, et des diverses propriétés physicochimiques de la membrane lipidique elle-même, les protéines membranaires continuent de représenter un problème important lors de la mise en œuvre de techniques de biologie structurelle pour les étudier. De ces propriétés intrinsèques, la plus importante pour obtenir des informations structurelles précises est l’exigence d’avoir des interactions avec leur environnement lipidique naturel pour qu’ils maintiennent leur structure et leur fonction indigènes. L’environnement lipidique fait tellement partie intégrante de la structure et de la fonction des protéines membranaires que le concept de mémtéine (une combinaison des mots membrane et protéine) a été proposé comme unité fondamentale de la structure membranaire-protéique et de la^{fonction 11}. Malgré l’importance des interactions lipidiques-protéines, les techniques de détermination de l’IPP basées sur la structure actuellement disponibles exigent souvent que les protéines étudiées soient solubles ou solubilisées avec des détergents. L’exposition à des détergents durs peut dénaturer les protéines ou causer de faux positifs et négatifs dus à la délipidation, qui peut induire l’agrégation, la dénaturation des protéines, la dissociation des interactions non covalentes et la formation d’états oligomériques artificiels. En raison de la nécessité de maintenir un environnement lipidique naturel pour la détermination précise de l’état oligomérique indigène des protéines membranaires, nous avons développé un système de nanoparticules de membrane cellulaire indigène (NCMNs)¹² basé sur les particules de lipides mâles mâles (SMALP) précédemment rapportées (SMALP)¹³ méthode.

SMALP utilise le copolymère acide masculin styrène comme polymère actif membranaire pour extraire et solubiliser les protéines membranaires. Poly (Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) est un polymère amphiphilique unique en raison de sa mastic styrène hydrophobe et diamétralement opposée à la moiety acide masculin hydrophilique. Il forme des nanoparticules en adsorber, déstabilisant et perturbant la membrane cellulaire dans un mécanisme dépendant du pH¹⁴. Cette activité fonctionnelle de SMA est ce qui lui permet d’être utilisé comme un système sans détergent pour l’extraction des protéines membranaires et la solubilisation. Le système NCMN est distinct du système SMALP à plusieurs égards. La caractéristique la plus unique du système NCMN est qu’il dispose d’une bibliothèque de polymères actifs membranaires avec une multitude de polymères qui ont des propriétés uniques qui les rendent adaptés à l’isolement de nombreuses protéines membranaires différentes qui nécessitent des conditions différentes pour la stabilité et le fonctionnement natif. Le système NCMN a également des protocoles différents par rapport à la méthode SMALP quand il s’agit de préparer les nanoparticules. Un tel exemple est que les NCMN utilisent une purification de colonne d’affinité de nickel en une seule étape pour la détermination de la structure à haute résolution; l’effet de ces différents protocoles peut être observé lors de la comparaison du protocole NCMNs, qui a généré 3.2 et 3.0 Å cryo-EM AcrB structures, avec une étude similaire utilisant la méthode SMALP, qui a abouti à une structure cryo-EM AcrB à une résolution 8.8 Å^12,15. Ces caractéristiques uniques du système NCMN sont les améliorations apportées à la méthode SMALP précédemment établie et en font un candidat idéal pour l’étude des IPP.

Le transporteur multidrogue efflux AcrB existe en tant qu’homotrimère fonctionnel dans E. coli¹². Une analyse mutagène a suggéré qu’une mutation unique de point de P223G, située sur une boucle qui est responsable de la stabilité du trimer d’AcrB, déstabilise l’état de trimer et donne un monomère d’AcrB une fois préparé avec le DDM détergent, qui pourrait être détecté avec l’électrophoresis bleu indigène de gel^16. Cependant, l’analyse fret du mutant AcrB-P223G a suggéré que lorsque dans l’environnement de la bicouche lipidique de la membrane cellulaire indigène, la majorité des mutants AcrB-P223G existaient encore en tant que trimer et que les niveaux d’expression pour les deux types sauvages AcrB et AcrB-P223G sont similaires. Pourtant, malgré les résultats de l’analyse fret, un essai d’activité pour le transporteur mutant a montré que l’activité a considérablement diminué par rapport au type^{sauvage 16}. Bien que la technologie FRET ait été populairement utilisée pour l’analyse des interactions protéines-protéines, la recherche a montré qu’elle peut souvent donner de faux positifs^17,18,19,20.

Récemment, des structures cryo-EM à haute résolution du trimer AcrB ont été déterminées qui ont montré l’interaction de l’AcrB avec sa bicouche lipidique de membrane cellulaire indigène associée par l’utilisation des NCMNs^12. En principe, les NCMN peuvent facilement être utilisés pour l’analyse des interactions protéine-protéine trouvées sur la membrane cellulaire indigène. Lors d’un test de ce système, des expériences ont été menées pour observer directement l’état oligomérique de l’AcrB-P223G avec l’utilisation de nanoparticules de membrane cellulaire indigène et de microscopie électronique colorante négative. Afin de comparer avec les nanoparticules sauvages de type AcrB, nous avons utilisé le même polymère actif membranaire (SMA2000 fabriqué dans notre laboratoire, qui est indexé comme NCMNP1-1 dans la bibliothèque NCMN) utilisé pour la détermination de la structure cryo-EM à haute résolution de l’AcrB et des polymères alternatifs trouvés dans la bibliothèque^{nCMNs 12}. D’après les résultats précédemment rapportés, on s’attendait à ce que la majorité du mutant AcrB-P223G existe sous forme de nanoparticules de membrane cellulaire indigène trimeric²¹. Cependant, aucun trimers AcrB n’a été trouvé présent dans l’échantillon, comme ceux qui ont été observés avec le type sauvage AcrB. Ceci suggère que la majorité d’AcrB-P223G ne forme pas de garnitures sur la membrane cellulaire indigène comme précédemment suggéré.

Ici, nous rapportons une analyse détaillée du mutant E. coli AcrB-P223G dans une comparaison avec le type sauvage E. coli AcrB en utilisant les NCMN. Cette étude de cas de l’AcrB suggère que les NCMN sont un bon système pour l’analyse d’interaction protéine-protéine.