מערכת חלקיקי קרום התא המקורי לניתוח אינטראקציה של חלבון-חלבון קרום

אינטראקציות חלבון חלבון (PPI) ממלאות תפקידים מרכזיים בביולוגיה, החל מתחזוקת המבנה והתפקוד של חלבונים ועד לוויסות מערכות שלמות. PPIs מגיעים בצורות רבות ושונות וניתן לסווג על סמך סוגי האינטראקציות שהם יוצרים. סיווג אחד כזה הוא הומו-אוליגומרי או הטרואוליגומרי, בהתבסס על השאלה אם האינטראקציות הן בין יחידות משנה זהות או חלבונים שונים הפועלים כיוני משנה. סיווג נוסף מבוסס על עוצמת האינטראקציה אם האינטראקציות מובילות להיווצרות קומפלקסים יציבים או מצבים מורכבים חולפים. מידע מבני על PPIs בין חלבונים הוא חיוני בהבנת המנגנון שבאמצעותו חלבונים לבצע את תפקידם. ההערכה היא כי מעל 80% של חלבונים להסתמך על היווצרות מורכבת על מנת לבצע את תפקידם התפקודי¹. בהתחשב באחוז החלבונים שנצפו להסתמך על PPIs לתפקוד מולד תקין משמעותם בביולוגיה ניכרת בקלות, אך היכולת לחקור כראוי את החלבונים העוסקים באינטראקציות אלה נותרה מאתגרת בשל מגבלות בטכניקות הזמינות לצפייה ניסיונית כאשר חלבונים יוצרים PPIs.

יש רמה גבוהה של חילוקי דעות בין התוצאות עבור PPIs רבים שנקבעו בניסויים בשל כמות גבוהה של רעש, תוצאות חיוביות שגויות, ותשלילים כוזבים הנגזרים רבים של טכניקות קביעת PPI זמין כיום. זה במיוחד עבור מערכת שמרים דו-היברידית (Y2H), ספקטרומטריית טיהור-מסה טנדם (TAP-MS), והעברת אנרגיה תהודה פלואורסצנטית (FRET), המייצגים שלוש מהשיטות הנפוצות ביותר לקביעת PPI^2,3,4,5,6,7. לשם השוואה, ניתן להשתמש בטכניקות ביולוגיה מבנית של חלבונים, כגון תהודה מגנטית גרעינית (NMR), קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן ומיקרוסקופ אלקטרונים (EM), כדי להשיג מידע מבני ברזולוציה גבוהה על אינטראקציות חלבון-חלבון עד לרמה האטומית ולאפשר אישור חזותי ישיר של האינטראקציות המתרחשות עבור חלבון יעד בעל עניין. כל PPI שאינו מבוסס על מבנה זמין כיום הקובע טכניקות מחקר (למשל, Y2H, TAP-MS ו- FRET) חסר יכולת זו ובנוסף סובלים מקושי בזיהוי אינטראקציות חלשות וחולפות בין חלבונים⁵. חסרונות אלה משופרים עוד יותר כאשר לומדים חלבונים קרום בשל המורכבות הנוספת הביא על ידי המשתנה הנוסף של סביבת השומנים המשפיעה על היווצרות של מבנה quaternary הנכון הרכבה מורכבת הטרומרית.

חלבוני ממברנה מהווים חלק גדול של פרוטאום ידועים לשחק תפקידים מכריעים רבים בתפקוד התא תקין בתוך כל האורגניזמים החיים. למרות העובדה כי חלבוני ממברנה מוערך לפצות 27% של הגנום האנושי ומהווים ~ 60% מכל מטרות התרופה הנוכחית יש אנומליה גדולה במספר המודלים שנפתרו עבור חלבוני ממברנה המהווים רק ~ 2.2% מכלל מבני החלבון שפורסמו^8,9,10. הגורם העיקרי לפער בזמינות של מידע מבני טמון בתכונות המהותיות של חלבוני הממברנה עצמם. בשל המסיסות הירודה שלהם, הסתמכות על אינטראקציות עם סביבת השומנים לשמירה על מבנה ותפקוד מקומיים, ותכונות פיזיוכימיות שונות של קרום השומנים עצמו, חלבוני קרום ממשיכים לייצג בעיה משמעותית בעת יישום טכניקות ביולוגיה מבנית כדי ללמוד אותם. מבין תכונות מהותיות אלה, החשוב ביותר להשגת מידע מבני מדויק הוא הדרישה לקיים אינטראקציות עם סביבת השומנים הטבעית שלהם כדי לשמור על המבנה והתפקוד המקוריים שלהם. סביבת השומנים היא חלק בלתי נפרד מהמבנה והתפקוד של חלבוני הממברנה שהמושג של ממטאין (שילוב של המילים קרום וחלבון) הוצע כיחידה הבסיסית של מבנה חלבון קרום ותפקוד¹¹. למרות החשיבות של אינטראקציות חלבון השומנים, טכניקות קביעת PPI המבוססות על מבנה הזמינות כיום דורשות לעתים קרובות שהחלבונים הנחקרים יהיו מסיסים או יהיו מסיסים בחומרי ניקוי. חשיפה לחומרי ניקוי קשים יכולה לרוקן את החלבונים או לגרום לחיוביות ותשלילים כוזבים עקב דילול, אשר יכול לגרום לצבירה, denaturation של חלבון, ניתוק של אינטראקציות שאינן covalent, היווצרות של מצבים אוליגומריים מלאכותיים. בשל הצורך בשמירה על סביבת שומנים טבעית לקביעה מדויקת של המצב האוליגומרי המקורי של חלבוני ממברנה פיתחנו מערכת חלקיקי קרום התא המקומי (NCMNs)¹² בהתבסס על שיטת Styrene Maleic Acid Lipid (SMALP)¹³ שדווחה בעבר.

SMALP משתמשת בקופולימר חומצה גברית סטירן כמו פולימר פעיל קרום כדי לחלץ ולטבול חלבוני קרום. פולי (Styrene-co-Maleic Acid) הוא פולימר אמפיפילי ייחודי בשל הסטירן ההידרופובי שלו moiety ו diametricic מול חומצה גברית הידרופילית moiety. זה יוצר חלקיקים על ידי ספיחה, ערעור היציבות, ושיבוש קרום התא במנגנון תלוי pH¹⁴. פעילות תפקודית זו של SMA היא המאפשרת לו להיות מנוצל כמערכת ללא חומרי ניקוי עבור מיצוי חלבון קרום ו solubilization. מערכת NCMN נבדלת ממערכת SMALP במספר היבטים. התכונה הייחודית ביותר של מערכת NCMN היא שיש לה ספריית פולימר פעילה קרום עם שפע של פולימרים בעלי תכונות ייחודיות שהופכות אותם מתאימים לבידוד של חלבוני ממברנה רבים ושונים הדורשים תנאים שונים ליציבות ותפקוד ילידי. למערכת NCMN יש גם פרוטוקולים שונים בהשוואה לשיטת SMALP כשמדובר בהכנת הננו-חלקיקים. דוגמה אחת לכך היא ש- NCMNs משתמשים בטיהור עמודת זיקה ניקל חד-שלבית לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה; ההשפעה של פרוטוקולים שונים אלה ניתן לראות בעת השוואת פרוטוקול NCMNs, אשר יצר 3.2 ו 3.0 Å קריו-EM AcrB מבנים, עם מחקר דומה באמצעות שיטת SMALP, אשר הביא מבנה AcrB cryo-EM ב 8.8 Å^{רזולוציה 12,15}. תכונות ייחודיות אלה של מערכת NCMN הן השיפורים שנעשו בשיטת SMALP שהוקמה בעבר ולהפוך אותה למועמד אידיאלי לחקר PPIs.

טרנספורטר efflux multidrug AcrB קיים כהומוטרימר פונקציונלי ב E. coli¹². ניתוח מוטגני הציע כי מוטציה נקודת P223G אחת, הממוקמת על לולאה האחראית ליציבות של שולי AcrB, מערערת את מצב השליש ומניבה מונומר AcrB כאשר הוא מוכן עם DDM חומר הניקוי, אשר יכול להיות מזוהה עם אלקטרופורזה ג’ל כחול יליד¹⁶. עם זאת, ניתוח FRET של מוטציית AcrB-P223G הציע כי כאשר בסביבת bilayer השומנים קרום התא המקורי, רוב מוטציה AcrB-P223G עדיין היה קיים כמו טרימר וכי רמות הביטוי עבור שני סוג פראי AcrB ו AcrB-P223G דומים. עם זאת, למרות תוצאות ניתוח FRET, בדיקה פעילות עבור טרנספורטר מוטנטים הראה כי הפעילות ירדה באופן דרמטי בהשוואה לסוג פראי¹⁶. למרות טכנולוגיית FRET שימשה העממית לניתוח של אינטראקציות חלבון חלבון, מחקרים הראו כי זה יכול לעתים קרובות לתת תוצאות חיוביות שגויות^17,18,19,20.

לאחרונה, מבנים ברזולוציה גבוהה cryo-EM של טרימר AcrB נקבעו אשר הראו את האינטראקציה של AcrB עם bilayer השומנים קרום התא המקורי המשויך שלה באמצעות NCMNs¹². באופן עקרוני, NCMNs יכול להיות מנוצל בקלות לניתוח של אינטראקציות חלבון חלבון נמצאו על קרום התא המקומי. במבחן של מערכת זו, ניסויים בוצעו כדי לבחון ישירות את המצב האוליגומרי של AcrB-P223G עם שימוש חלקיקי קרום התא המקומי מיקרוסקופ אלקטרונים כתמים שליליים. כדי להשוות עם חלקיקי AcrB מסוג פראי, השתמשנו באותו פולימר פעיל קרום (SMA2000 שנעשו במעבדה שלנו, אשר אינדקס כמו NCMNP1-1 בספריית NCMN) המשמש לקביעת מבנה cryo-EM ברזולוציה גבוהה של AcrB ופולימרים חלופיים שנמצאו בספריית NCMNs¹². בהתבסס על התוצאות שדווחו בעבר, זה היה צפוי כי רוב מוטציה AcrB-P223G יתקיים בצורה של חלקיקי קרום תא מקורי טריטרי²¹. עם זאת, לא נמצאו חותכי AcrB במדגם, כגון אלה שנצפו עם סוג הפרא AcrB. זה מרמז על הרוב של AcrB-P223G אינו יוצר קוצצים על קרום התא המקורי כפי שהוצע בעבר.

כאן אנו מדווחים על ניתוח מפורט של המוטנט E. coli AcrB-P223G בהשוואה לסוג הפראי E. coli AcrB באמצעות NCMNs. מקרה מבחן זה של AcrB מצביע על NCMNs היא מערכת טובה לניתוח אינטראקציה חלבון חלבון.