Родная клеточная мембрана наночастицы системы membrane белка-белкового взаимодействия анализа

Белково-белковые взаимодействия (ИЦП) играют ключевую роль на протяжении всей биологии, от поддержания структуры и функции белков до регуляции целых систем. ИЦП бывают разных форм и могут быть классифицированы в зависимости от того, какие типы взаимодействий они формируют. Одной из таких категоризации является гомоолигомерная или гетероолигомерная, основанная на том, находятся ли взаимодействия между идентичными субъединицами или различными белками, действующими в качестве субъедилентов. Другая категоризация основана на силе взаимодействия, если взаимодействия приводят к формированию стабильных комплексов или переходных сложных состояний. Структурная информация о ИЦП между белками имеет решающее значение для понимания механизма, с помощью которого белки выполняют свою функцию. Было подсчитано, что более 80% белков полагаются на сложное образование для того, чтобы выполнять свои функциональные функции¹. Учитывая процент белков наблюдается полагаться на ИЦП для надлежащего врожденного функционирования их значение в биологии является очевидным, но возможность правильно исследовать белки, которые участвуют в этих взаимодействий остается сложной задачей из-за ограничений в методах, доступных для экспериментального наблюдения, когда белки формируют ИЦП.

Существует высокая степень разногласий между результатами для многих экспериментально определенных ИЦП из-за большого количества шума, ложных срабатываний и ложных негативов, которые являются производными от многих из имеющихся в настоящее время методов определения ИЦП. Это особенно актуально для дрожжей двух-гибридной (Y2H) системы, тандем сродства очистки массы спектрометрии (TAP-MS), и флуоресценции резонансной передачи энергии (FRET), которые представляют собой три из^{наиболее часто используемых методов для}определения ИЦП 2^,3,4,5,6,7. Для сравнения, методы структурной биологии белка, такие как ядерный магнитный резонанс (NMR), рентгеновская кристаллография и электронная микроскопия (EM), могут быть использованы для получения структурной информации высокого разрешения о белково-белковых взаимодействиях вплоть до атомного уровня и позволяют прямое визуальное подтверждение взаимодействий, происходящих для целевого белка интереса. Все имеющиеся в настоящее время неконституции на основе ИЦП определения методов исследования (например, Y2H, TAP-MS, и FRET) не имеют этой способности и дополнительно страдают от трудностей в выявлении слабых и переходных взаимодействий между^{белками 5}. Эти недостатки еще больше усиливаются при изучении мембранных белков из-за дополнительной сложности, вызванной дополнительной переменной липидной среды, которая влияет на формирование надлежащей четвертичных структур и гетеромерной сложной сборки.

Мембранные белки составляют большую часть протеома и, как известно, играют важную роль в надлежащем функционировании клеток во всех живых организмах. Несмотря на то, что мембранные белки, по оценкам, составляют 27% генома человека и составляют 60% от всех текущих целей наркотиков есть серьезная аномалия в количестве решенных моделей мембранных белков, которые составляют лишь 2,2% от всех опубликованных^{белковых структур 8,9,10}. Основная причина расхождения в доступности структурной информации заключается в внутренних свойствах самих мембранных белков. Из-за их плохой solubility, опоры на взаимодействия с липидной средой для поддержания родной структуры и функции, и различные физико-химические свойства самой липидной мембраны, мембранные белки продолжают представлять собой существенную проблему при реализации структурных методов биологии для их изучения. Из этих свойств, наиболее важным для получения точной структурной информации является требование иметь взаимодействия с их естественной липидной среды для них, чтобы сохранить свою родную структуру и функцию. Липидная среда является такой неотъемлемой частью структуры и функции мембранных белков, что концепция memtein (сочетание слов мембраны и белка) была предложена в качестве основной единицы мембраны-белковой структуры и^{функции 11}. Несмотря на важность липидно-белковых взаимодействий, имеющиеся в настоящее время методы определения ИЦП на основе структуры часто требуют, чтобы изучаемые белки были растворимыми или растворялись моющими средствами. Воздействие суровых моющих средств может денатурировать белки или вызвать ложные срабатывания и негативы из-за делипидации, которые могут вызвать агрегацию, денатурацию белка, диссоциацию нековалентных взаимодействий и образование искусственных олигомерных состояний. В связи с необходимостью поддержания естественной липидной среды для точного определения родного олигомерного состояния мембранных белков мы разработали систему наночастиц коренных клеток Membrane (NCMNs)¹² на основе ранее зарегистрированного метода Styrene Maleic Acid Lipid Particles (SMALP)^13.

SMALP использует стирола мужской кислоты кополитера в качестве мембраны активного полимера для извлечения и solubilize мембранных белков. Поли (Styrene-co-Maleic Acid) (SMA) является уникальным амфифилическим полимером из-за его гидрофобного стирола moiety и диаметрально противоположных гидрофильных мужских кислот moiety. Он образует наночастицы путем адсорбирования, дестабилизации и нарушения клеточной мембраны в рН-зависимом механизме^14. Эта функциональная деятельность SMA является то, что позволяет использовать его в качестве моющего средства свободной системы для извлечения мембранного белка и solubilization. Система NCMN отличается от системы SMALP по нескольким аспектам. Самой уникальной особенностью системы NCMN является то, что она имеет мембранную активную полимерную библиотеку с множеством полимеров, которые имеют уникальные свойства, которые делают их пригодными для изоляции различных мембранных белков, которые требуют различных условий для стабильности и постоянного функционирования. Система NCMN также имеет различные протоколы по сравнению с методом SMALP, когда дело доходит до подготовки наночастиц. Одним из таких примеров является то, что NCMNs используют одноступенчатую очистку столбца сродства никеля для определения структуры с высоким разрешением; эффект этих различных протоколов можно наблюдать при сравнении протокола NCMNs, который генерируется 3,2 и 3,0 кро-EM AcrB структур, с аналогичным исследованием с использованием метода SMALP, в результате чего крио-EM AcrB структуры на 8,8^{й разрешение 12,15}. Эти уникальные особенности системы NCMN являются улучшения, сделанные на ранее установленный метод SMALP и сделать его идеальным кандидатом для изучения ИЦП.

Многоразовой эффлюкс транспортер AcrB существует как функциональный гомотример в кишечной палочке¹². Мутагеничный анализ показал, что одна мутация точки P223G, расположенная на петле, которая отвечает за стабильность тримера AcrB, дестабилизирует состояние тримера и дает мономер AcrB при приготовлении с моющим средством DDM, который может быть обнаружен с помощью родного синего^{геля электрофорез 16}. Тем не менее, анализ FRET мутанта AcrB-P223G показал, что, когда в среде липидного бислойного облизываемых клеток, большинство мутантов AcrB-P223G все еще существовали как тример и что уровни экспрессии как для дикого типа AcrB, так и для AcrB-P223G похожи. Тем не менее, несмотря на результаты анализа FRET, анализ активности для мутантного транспортера показал, что активность резко снизилась по сравнению с диким типом^16. Хотя технология FRET широко используется для анализа белково-белковых взаимодействий, исследования показали, что она часто может давать ложные^{срабатывания 17,18,19,20}.

Недавно были определены крио-ЭМ-структуры тримера AcrB, которые показали взаимодействие AcrB с связанным с ним липидным бислойным бислойным липидным бислоем из^{местных клеток}с помощью NCMNs 12 . В принципе, NCMNs можно охотно использовать для анализа взаимодействий протеин-протеина найденных на родной мембране клетки. В ходе испытания этой системы были проведены эксперименты по непосредственному наблюдаю за олигомерным состоянием AcrB-P223G с использованием наночастиц наночастиц на мембраны родных клеток и отрицательной окрашивающей электронной микроскопией. Для сравнения с наночастицами дикого типа AcrB мы использовали тот же мембранный активный полимер (SMA2000, сделанный в нашей лаборатории, который индексирован как NCMNP1-1 в библиотеке NCMN), используемый для определения структуры AcrB с высоким разрешением и альтернативных полимеров, найденных в библиотеке NCMNs^12. Основываясь на ранее сообщенных результатах, ожидалось, что большинство мутантов AcrB-P223G будет существовать в виде тримерных наночастиц^{наночастиц на мембраны родной клетки 21}. Тем не менее, не AcrB тримеры были найдены присутствующих в образце, таких, как те, которые наблюдались с диким типом AcrB. Это говорит о том, что большинство AcrB-P223G не формирует тримеры на мембране родной клетки, как предполагалось ранее.

Здесь мы сообщаем подробный анализ мутанта E. coli AcrB-P223G в сравнении с диким типом E. coli AcrB с использованием NCMNs. Это исследование AcrB предполагает, что NCMNs является хорошей системой для анализа взаимодействия белка и белка.