Summary

Analisi di competenza vettoriale sulle zanzare Aedes aegypti utilizzando il virus Zika

Published: May 31, 2020
doi:

Summary

Il protocollo presentato può determinare la competenza vettoriale delle popolazioni di zanzare Aedes aegypti per un dato virus, come Zika, in un ambiente di contenimento.

Abstract

Le procedure presentate descrivono una metodologia generalizzata per infettare le zanzare Aedes aegypti con il virus Zika in condizioni di laboratorio per determinare il tasso di infezione, l’infezione disseminata e la potenziale trasmissione del virus nella popolazione di zanzare in questione. Queste procedure sono ampiamente utilizzate con varie modifiche nelle valutazioni delle competenze vettoriali a livello globale. Sono importanti nel determinare il ruolo potenziale che una data zanzara (cioè specie, popolazione, individuo) può svolgere nella trasmissione di un determinato agente.

Introduction

La competenza vettoriale è definita come la capacità a livello di specie, popolazione e persino individuo, di un dato artropode come una zanzara, una zecca o una mosca di sabbia flebotomina, di acquisire e trasmettere un agente biologicamente con replicazione o sviluppo nell’artropode1,2. Per quanto riguarda le zanzare e i virus trasmessi dagli artropodi (cioè gli arbovirus), l’agente viene assorbito da un ospite viremico da una zanzara femmina. Dopo l’ingestione, il virus deve infettare in modo produttivo una di una piccola popolazione di cellule epiteliali dell’intestino medio3, superando vari ostacoli fisiologici come la degradazione proteolitica da parte degli enzimi digestivi, la presenza del microbiota (barriera di infezione dell’intestino medio, o MIB) e la matrice peritrofica secreta. L’infezione dell’epitelio midgut deve essere seguita dalla replicazione del virus e dall’eventuale fuga dal midgut nel sistema circolatorio aperto della zanzara, o emolinfa, che rappresenta l’insorgenza di un’infezione disseminata che supera la barriera di fuga del midgut (MEB). A questo punto il virus può stabilire infezioni dei tessuti secondari (ad esempio, nervi, muscoli e corpi adiposi) e continuare a replicarsi, sebbene tale replicazione secondaria possa non essere strettamente necessaria affinché il virus infetti le cellule acinari delle ghiandole salivari (superando la barriera di infezione della ghiandola salivare). L’uscita dalle cellule acinari della ghiandola salivare nelle loro cavità apicali e quindi il movimento nel dotto salivare consente l’inoculazione del virus in ospiti successivi al morso e completa il ciclo di trasmissione1,2,4,5,6,7.

Dato questo meccanismo di diffusione ben caratterizzato e generalmente conservato all’interno di un vettore di zanzara, le valutazioni delle competenze vettoriali di laboratorio sono spesso metodologicamente simili, sebbene esistano differenze nei protocolli1,2. Generalmente, dopo l’esposizione orale al virus, le zanzare vengono sezionate in modo che i singoli tessuti come l’intestino medio, le gambe, le ovaie o le ghiandole salivari possano essere analizzati per l’infezione virale, l’infezione disseminata, l’infezione disseminata / potenziale trasmissione transovarica e l’infezione disseminata / potenziale competenza di trasmissione, rispettivamente8. La semplice presenza di un virus nelle ghiandole salivari, tuttavia, non è una prova definitiva della capacità di trasmissione, data l’evidenza di una barriera di fuga/uscita della ghiandola salivare (SGEB) in alcune combinazioni vettore/virus1,2,4,5,7,9. Il metodo standard per dimostrare la competenza di trasmissione rimane la trasmissione delle zanzare a un animalesuscettibile10,11,12. Tuttavia, dato che per molti arbovirus ciò richiede l’uso di modelli murini immunocompromessi13,14,15,16,questo metodo è spesso proibitivo in termini di costi. Un’alternativa comunemente usata è la raccolta della saliva della zanzara, che può essere analizzata mediante reazione a catena trascrizione inversa-polimerasi (RT-PCR) o un test infettivo per dimostrare la presenza del genoma virale o di particelle infettive, rispettivamente. Vale la pena notare che tali metodi di raccolta della saliva in vitro possono sovrastimare12 o sottostimare17 la quantità di virus depositata durante l’alimentazione in vivo, indicando che tali dati devono essere interpretati con cautela. Tuttavia, il metodo in vitro è molto prezioso se analizzato dal punto di vista della semplice presenza di virus nella saliva, indicando il potenziale di trasmissione.

Esistono due approcci principali per determinare il ruolo dei vettori di zanzare nelle epidemie di malattie arbovirali. Il primo metodo prevede la sorveglianza sul campo, in cui le zanzare vengono raccolte nel contesto della trasmissione attiva18,19,20,21,22,23,24. Tuttavia, dato che i tassi di infezione sono in genere piuttosto bassi (ad esempio, il tasso di infezione stimato dello 0,061% delle zanzare nelle aree di circolazione attiva del virus Zika (ZIKV) negli Stati Uniti21), l’incriminazione di potenziali specie di vettori può essere fortemente distorta dalla metodologia di cattura25,26 e dalla casualità (ad esempio, campionando un individuo infetto su 1.600 non infetti)21 . Tenendo conto di ciò, un determinato studio potrebbe non acquisire zanzare sufficienti sia in numero grezzo che in diversità di specie per campionare accuratamente le zanzare coinvolte nella trasmissione. Al contrario, le analisi della competenza vettoriale vengono eseguite in un ambiente di laboratorio, consentendo un controllo rigoroso di parametri come la dose orale. Sebbene non pienamente in grado di rappresentare la vera complessità dell’infezione da zanzara e la capacità di trasmissione in un ambiente di campo, queste valutazioni di laboratorio rimangono potenti strumenti nel campo dell’arbovirologia.

Sulla base di varie analisi di competenza vettoriale con ZIKV in diverse specie di zanzare, popolazioni e metodi27,28,29,30,31,32,nonché di una recente revisione delle valutazioni della competenza vettoriale1,descriviamo qui molti dei protocolli associati a un tipico flusso di lavoro di competenza vettoriale. In questi esperimenti, tre popolazioni di Ae. aegypti provenienti dalle Americhe (la città di Salvador, Brasile; repubblica Dominicana; e la bassa valle del Rio Grande, TX, USA) sono state esposte a un singolo ceppo di ZIKV (Mex 1-7, GenBank Accession: KX247632.1) a 4, 5 o 6 log10 unità di focalizzazione (FFU) / mL dosi sotto forma di farine di sangue artificiali. Successivamente, sono stati analizzati per prove di infezione, infezione disseminata e competenza di trasmissione dopo vari periodi di incubazione estrinseca (2, 4, 7, 10 e 14 giorni) mediante dissezione e un test infettivo basato su colture cellulari. Sebbene l’attuale flusso di lavoro / protocolli sia ottimizzato per ZIKV, molti elementi sono direttamente traducibili in altri arbovirus trasmessi dalle zanzare nel contenimento degli artropodi e nei livelli di biosicurezza 2 e 3 (ACL / BSL2 o ACL / BSL3).

Protocol

Tutte le procedure eseguite in questi protocolli sono state eseguite nel pieno rispetto dei protocolli approvati dall’Institutional Biosafety Committee e dall’Institutional Animal Care and Use Committee della University of Texas Medical Branch di Galveston. 1. Amplifica ZIKV nelle celle Vero Coltiva cellule Vero (CCL-81 o VeroE6) nella modifica di Dulbecco del mezzo essenziale minimo (DMEM) di Eagle integrato con il 10% v / v siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS) e l’1% (v …

Representative Results

Tre popolazioni di Ae. aegypti provenienti dalle Americhe (Salvador, Brasile; Repubblica Dominicana; e la Valle del Rio Grande, TX, USA) sono state esposte a un ceppo epidemico di ZIKV dalle Americhe (ZIKV Mex 1-7, Stato del Chiapas, Messico, 2015) su una gamma di titoli di farina di sangue (4, 5 e 6 log10 FFU / mL) presentati in una farina di sangue artificiale a base di eritrociti umani lavati. Nei giorni 2, 4, 7, 10 e 14 postnfection, sottoinsiemi di zanzare sono stati elaborati per determinare l’i…

Discussion

I metodi qui descritti forniscono un flusso di lavoro generalizzato per condurre analisi delle competenze vettoriali. Come quadro generale, molte di queste metodologie sono conservate in tutta la letteratura. Tuttavia, c’è un notevole spazio per le modifiche (recensito in Azar e Weaver1). Virus (ad esempio, lignaggio virale, conservazione del virus di sfida, storia di passaggio virale), entomologia (ad esempio, colonizzazione di laboratorio di popolazioni di zanzare, immunità innata, microbioma …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Riconosciamo lo staff del World Reference Center for Emerging Viruses and Arboviruses (WRCEVA): Dr. Robert Tesh, Hilda Guzman, Dr. Kenneth Plante, Dr. Jessica Plante, Dionna Scharton e Divya Mirchandani, per il loro instancabile lavoro nel curare e fornire molti dei ceppi virali utilizzati per gli esperimenti di competenza vettoriale nostri e di altri gruppi. Il lavoro presentato è stato finanziato dal McLaughlin Fellowship Fund (SRA) e dalle sovvenzioni NIH AI120942 e AI121452.

Materials

3mL Standard Reservoir R37P30 Hemotek Ltd Insectary Equipment
7/32" Stainless Steel 440 Grade C Balls 4RJH9 Grainger Grinding Media
Acetone, Histological Grade, Fisher Chemicals, Poly Bottle, 4L, 4/Case A16-P4 FisherScientific Fixative
Adenosine 5'-triphospate disodium salt hydrat, microbial, BioReagent, suitable for cell culture A6419-1G MilliporeSigma Reagent
Anti-Flavivirus Group Antigen Antibody, clone D1-4G2-4-15 MAB10216 MilliporeSigma Primary Antibody for focus forming assay
Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, Human Serum Adsorbed and Peroxidase-Labeled, 1.0mL/Bottle 5450-0011 KPL/Seracare Secondary Antibody for focus forming assay
Bleach NC0427256 FisherScientific Decontamination
Corning, Cell Culture Treated Flasks, 150cm2, Vented Cap, Case of 50 10-126-34 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 24-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-740 FisherScientific Cell culture consumable
Costar Cell Culture Plates, 96-well, 5/bag, 100/case, Corning 07-200-91 FisherScientific Cell culture consumable
Crystal Violet C0775-100G MilliporeSigma Stain
Eppendorf Snap Cap Microcentrifuge Safe-Lock 2mL Tubes, 500/Case 05-402-7 FisherScientific Plastic consumable
Falcon 15mL Conical Centrigue Tubes 14-959-70C FisherScientific Plastic consumable
Falcon 50mL Conical Centrigue Tubes 14-959-49A FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 10mL Pipets, 200/Case 13-675-20 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 1mL Pipets, 1000/Case 13-675-15B FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 25mL Pipets, 200/Case 13-675-30 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Disposable Polystyrene Serological 5mL Pipets, 200/Case 13-675-22 FisherScientific Plastic consumable
Falcon Standard Tissue Culture Dishes 08-772B FisherScientific Plastic consumable
Fetal Bovine Serum-Premium, 500mL S11150 Atlanta Biologicals Cell culture reagent
Fisherbrand Economy Plain Glass Microscope Slides 12-550-A3 FisherScientific Immobilization of Mosquitos
FU1 Feeder FU1-0 Hemotek Ltd Insectary Equipment; feeding units
Gibco DPBS with Calcium and Magnesium, 10 x 500mL Bottles 140-040-182 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco Fungizone, Amphotericin B, 250μg/mL, 50mL/Bottle 15-290-026 Fisher Scientific Cell culture reagent
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100mL/Bottle, 20 Bottles/Case 15-140-163 FisherScientific Cell culture reagent
Gibco, Tryptsin-EDTA (.25%), Phenol red, 20 x 100mL Bottles 25-200-114 FisherScientific Cell culture reagent
Gibcom DMEM, High Glucose, 10 x 500mL Bottles 11-965-118 FisherScientific Cell culture reagent
Human Blood, Unspecified Gender, Na-Citrate, 1 Unit 7203706 Lampire Bloodmeal preparation
InsectaVac Aspirator 2809B Bioquip Insectary Equipment
Methanol, Certified ACS, Fisher Chemicals, Amber Glass Bottle, 4L, 4/Case A412-4 FisherScientific Fixative
Methyl cellulose, viscosity: 3,500-5,600 cP, 2 % in water(20 °C), 250g/Bottle M0512-250G MilliporeSigma Cell culture reagent
Micro-chem Plus Disinfectant Detergent C849T34 Thomas Scientific Decontamination; working dilution of dual quaternary ammonium
Mineral Oil, BioReagent, for molecular biology M5904-5X5ML MilliporeSigma Immobilization of Mosquitos
O-rings OR37-25 Hemotek Ltd Insectary Equipment
Plastic Plugs PP5-250 Hemotek Ltd Insectary Equipment
PS6 Power Unit (110-120V) PS6120 Hemotek Ltd Insectary Equipment; power source
Rubis Forceps, Offset blades, superfine points 4525 Bioquip Insectary Equipment
Sarstedt Inc, 2mL Screw Cap Microtube, Conical Bottom, O-ring Cap, Sterile, 1000/Case 50-809-242 FisherScientific Plastic consumable
Sucrose, BioUltra, for molecular biology 84097-250G MilliporeSigma Reagent
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 1000μL Pipette Tips, 100 tips/Rack, 8 Racks/Pack, 4 Packs/Case 21-402-487 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 200μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-486 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention 20μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-484 FisherScientific Plastic consumable
ThermoScientific, ART Barrier Low Retention, Extended Reach 10μL Pipette Tips, 96 tips/Rack, 10 Racks/Pack, 5 Packs/Case 21-402-482 FisherScientific Plastic consumable
TissueLyser II 85300 QIAGEN Homogenization
TrueBlue Peroxidase Substrate Kit, 200mL 5510-0030 Seracare Developing solution for focus forming assay
Vero CCL-81 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay
Vero C1008 [Vero 76, clone E6, Vero E6] CRL-1586 American Type Culture Collection Mammalian cell line to amplify virus and conduct infectious assay

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Cite This Article
Azar, S. R., Weaver, S. C. Vector Competence Analyses on Aedes aegypti Mosquitoes using Zika Virus. J. Vis. Exp. (159), e61112, doi:10.3791/61112 (2020).

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