微生物工程”设计-构建-测试”周期的一个瓶颈是,我们可以执行应变功能屏幕的速度。我们描述了一种高通量方法,用于菌株筛选,应用于每个实验的数百至数千个酵母细胞,利用基于滴滴的RNA测序。
可用于编辑酵母基因组的强大工具使这种微生物成为工程的宝贵平台。虽然现在有可能构建数百万种基因独特的菌株库,但筛选所需的表型仍然是一个重大障碍。利用现有的筛选技术,信息输出和吞吐量之间存在权衡,高通量筛选通常对一个感兴趣的产品进行。因此,我们提出了一种方法,通过调整单细胞RNA测序到基因工程酵母菌株的等源皮果菌菌落,加速菌株筛选。为了应对在酵母细胞上执行RNA测序的独特挑战,我们在进行RNA测序之前,在水凝胶和球体中培养等源酵母菌菌菌菌菌。RNA测序数据可用于推断酵母表型和整理工程路径。我们方法的可扩展性解决了微生物工程中一个关键障碍。
微生物工程的主要目标是修改微生物,以诱导它们产生有价值的化合物11,2。2由于其易于培养和可用于工程其基因组33、4、54,5的工具,S. cerevisiae一直是微生物工程的主要有机体。然而,在改良酵母上执行功能屏幕仍有一个障碍:筛选吞吐量落后于基因组工程的量级。筛选通常涉及隔离微孔板中的菌株,并通过测量特定化合物66、77的产量来平分。这个过程的吞吐量受到在百微升反应中对单个菌株进行分析所需的大量试剂的限制。液滴微流体提供了一个有吸引力的解决方案,通过缩小通常在孔板8中执行的反应,提高酵母筛选的吞吐量。然而,与井板屏幕一样,滴层屏幕通常检测单个产品化合物,这为工程路径9、10、1110,的全球功能9提供了有限的信息。11
RNA测序(RNA-seq)可以通过允许所有相关基因的表达水平同时评估12,13,,13实现路径操作的更全面的表征。此外,滴脚方法允许每个实验对数千个细胞进行剖查,为筛选工程变体14、15,15的库提供了所需的吞吐量。然而,RNA-seq方法针对哺乳动物细胞进行了优化;相比之下,酵母每个细胞的mRNA较少,细胞壁难以去除16个,用现有方法排除了它们的测序。如果能够设计高通量滴法来实现酵母RNA-seq,它将为酵母工程提供一个可扩展、经济高效且信息丰富的解说平台。
我们介绍了我们最近开发的方法的详细协议,该方法使用高通量液滴微流体17测序酵母细胞。为了克服有限RNA的挑战,我们在皮升水凝胶球中封装并培养单个酵母细胞。培养复制细胞,产生数百份共享相同工程途径的拷贝;这减少了由于单细胞基因表达的变化,同时显著增加可用于测序的RNA量。在基于培养的扩增后,我们通过散装酶消化去除细胞壁。细胞膜保持完整,因此每个等源菌落及其相关的mRNA都封装在其水凝胶球体中。这使我们能够配对单个菌落与mRNA捕获试剂和赖塞缓冲液,和mRNA被捕获,条形码,并排序后,Drop-Seq工作流14。我们的方法允许每个实验对数千个等源酵母菌群进行转录。
我们的异感酵母菌群RNA测序方法(ICO-seq)适应已发布的单细胞RNA测序平台Drop-Seq,用于工程酵母菌株的高通量筛选。酵母细胞含有不到10%的典型哺乳动物细胞的mRNA拷贝,并且有一个细胞壁,需要在mRNA捕获16之前降解。这两个因素排除了酵母直接应用于滴-Seq或其他基于滴滴的scRNA-seq平台。为了解决这些问题,我们将单个细胞封装在水凝胶内,并将其培养成菌落,为RNA测序提供足够的输入材料,并在水解和mRNA捕获之前消化酵母细胞壁以产生球蛋白。与原始 Drop-Seq 工作流相比,这些更改增加了 ICO-seq 工作流的额外复杂性,是用户必须确保顺利进行的关键步骤。
将单个酵母细胞封装在琼脂水凝胶内,需要正确操作设备 A。必须正确计数输入酵母悬浮液,以尽量减少具有多个酵母细胞的水凝胶数量,同时确保足够的水凝胶包含单个细胞,以确保在mRNA捕获期间合理的细胞捕获效率。在微流体装置操作期间,琼脂凝胶混合物必须很好地溶解并通过注射器过滤器,以尽量减少设备堵塞的可能性。琼脂凝胶混合物是粘稠的,单通道分裂成八的区域特别容易堵塞。通过将高速摄像机居中以可视化设备该区域的设备操作,用户可以监控八个通道中每个通道中每个通道产生的液滴的均匀性,并在任何通道中的堵塞导致均匀性发生变化时快速做出反应。在显微镜下对少量收集的乳液进行检查,为确认高质量的乳液提供了辅助方法。
在水凝胶内酵母菌群生长后,为确保在单一菌体内提取优质mRNA,需要采取若干预防措施。优化酵母在水凝胶培养中的时间很重要,因为如果酵母在培养中离开太久,许多酵母将避开水凝胶的限制,导致RNA测序期间的背景信号较高,在细胞类型之间区分时灵敏度较低。使用Zymolyase正确生成球蛋白,确保mRNA在细胞接触溶酶缓冲液后被释放。继酶酶之后的酵母菌菌群的目视检查应产生更闪亮的酵母细胞。细胞壁消化不当会导致RNA捕获效率降低。最后,水凝胶在注入设备B时应紧密包装。 使用高速摄像机监测水凝胶输入,一旦水凝胶在输入到设备时不再紧密包装,则允许终止乳液收集,否则捕获效率就会受到影响。
我们方法的一个潜在问题是酵母的微凝胶培养可能显著改变基因表达。此前研究微凝胶和agar中的酵母基因表达的工作表明,基因表达平均值存在差异,但总体呈正相关17,不过对各种酵母菌株的进一步调查是谨慎的。该方法也具有有限的细胞捕获效率,由于随机加载mRNA捕获珠后,泊森统计14。目前约10%的滴液含有珠子和菌落,双封装率预计在1%以下。双封装导致在RNA-seq数据分析过程中混淆元素,其过滤仍然具有挑战性23;捕获率为 25% 将导致双倍封装相应增加到 5%(补充图 2)。虽然我们演示ICO-seq使用滴-seq平台,还有其他滴滴RNA-seq平台引入mRNA捕获珠确定,而不是统计,如商业上可用的10倍基因组铬平台15,24。15,将这些平台与 ICO-seq 集成,可以提高捕获效率,超越泊森统计数据所允许的范围。最后,滴滴RNA-seq的一个基本限制是测序后无法恢复感兴趣的细胞。在考虑使用此方法分析酵母库的类型时,应考虑此限制。
细胞对细胞异质性已被证明在克隆水平微生物,如大肠杆菌25和S。cerevisiae26揭示新的细胞指出,大容量级分析否则会掩盖。对C.白化体进行的体积RNA-seq分析倾向于观察全种群转录血转录的变化,或者将白色和不透明细胞作为两个独立的种群27、28。,28ICO-seq的应用可能导致发现更多的子状态,并为发现其他酵母物种中的新细胞状态提供一个分析框架。然而,水凝胶内细胞的生长并不仅限于酵母:其他细胞类型,如哺乳动物、细菌和其他真菌细胞也可以在水凝胶29、30,30内培养。异源菌落与单细胞的测序导致细胞间变异导致生物噪声平均消除,从而改善细胞类型之间的鉴别。这在分析遗传多样性以特定合成途径为核心的细胞时可能会有所帮助。细胞类型输入ICO-seq的可能性扩大,以及其与商用液滴RNA-seq平台的潜在集成,使ICO-seq成为在基因水平上解剖细胞异质性的有希望的平台。
The authors have nothing to disclose.
该项目得到了国家科学基金会职业奖DBI-1253293、国家卫生研究院新创新者奖DP2AR068129以及授予R01HG0008978、国家科学基金会技术中心授予DBI-1548297和UCSF细胞建设中心的支持。ARA和ZJG是陈-扎克伯格生物枢纽调查员。
0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | Used to make TE-TW buffer |
0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
1 mL syringes | BD | 309628 | |
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | Used to make TE-TW buffer |
27 gauge needles | BD | 305109 | |
3 mL syringes | BD | 309657 | |
3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | See Supplemental Files for 3D print file |
Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | a9414 | |
Aquapel (hydrophobic glass treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
Drop-Seq Beads | ChemGenes | MACOSKO-2011-10 | |
Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) | Corning | 294775X50 | |
Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref 14. Can substitute with PEG-PFPE surfactant. | ||
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Novec 7500 | 3M | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
PBS | Fisher Scientific | BP243820 | |
PE-2 polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
PEG-PFPE surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | See Supplemental Files for mask designs |
Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
SSC Buffer | Sigma-Aldrich | S6639 | |
SU-8 2100 | MicroChem | Y111075 | |
SU-8 2150 | MicroChem | Y111077 | |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Used to make TE-TW buffer |
YR Digestion buffer | Zymo Research | R1001-1 | Spheroplasting buffer |
YR Lysis Buffer | Zymo Research | R1001-2 | |
Zymolyase | Zymo Research | E1005 | Spheroplasting enzyme mixture |