والاختناق في دورة “التصميم وبناء الاختبار” من الهندسة الميكروبية هو السرعة التي يمكننا أن تؤدي شاشات وظيفية من سلالات. نحن نصف طريقة عالية الإنتاجية لفحص الإجهاد المطبقة على مئات إلى آلاف خلايا الخميرة لكل تجربة تستخدم تسلسل الحمض النووي الريبي القائم على قطرات.
جعلت الأدوات القوية المتاحة لـ تحرير جينوم الخميرة هذا الميكروب منصة قيمة للهندسة. وفي حين أنه من الممكن الآن بناء مكتبات لملايين السلالات المتميزة وراثيا، فإن فحص النمط الظاهري المطلوب لا يزال يشكل عقبة كبيرة. مع تقنيات الفحص الحالية ، هناك مقايضة بين إخراج المعلومات والإنتاجية ، مع إجراء فحص عالي الإنتاجية عادة على منتج واحد من المنتجات ذات الأهمية. لذلك ، نقدم نهجًا لتسريع فحص السلالة عن طريق تكييف تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لمستعمرات بيكولتر الأيزوجين لسلالات الخميرة المهندسة وراثيًا. للتصدي للتحديات الفريدة من أداء تسلسل الحمض النووي الريبي على خلايا الخميرة، ونحن ثقافة مستعمرات الخميرة الهينة داخل hydrogels وspheroplast قبل تنفيذ تسلسل الحمض النووي الريبي. يمكن استخدام بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي لاستنتاج الأنماط الظاهرية الخميرة وفرز المسارات المهندسة. إن قابلية أسلوبنا للانتشار تعالج عقبة حرجة في الهندسة الميكروبية.
الهدف الأساسي من الهندسة الميكروبية هو تعديل الميكروبات لحثها على إنتاج مركبات قيمة1،2. S. cerevisiae كان الكائن الرئيسي للهندسة الميكروبية نظرا لسهولة الثقافة واتساع الأدوات المتاحة لهندسة الجينوم3،4،5. ومع ذلك ، لا تزال هناك عقبة في أداء الشاشات الوظيفية على الخميرة المعدلة: يتخلف فحص الإنتاجية عن هندسة الجينوم حسب أوامر الحجم. الفحص عادة ما ينطوي على عزل سلالات في لوحات microwell وphenotyping لهم عن طريق قياس إنتاج مركب معين6,7. ومحدودة الإنتاجية من هذه العملية من قبل كميات كبيرة من الكاشف اللازمة لإجهاد الفردية في ردود فعل مائة ميكرولتر. يوفر السوائل الدقيقة القطرة حلا جذابا لزيادة الإنتاجية من فحص الخميرة من قبل أوامر من حجم عن طريق خفض ردود الفعل التي تؤديها عادة في لوحات جيدا8. ومع ذلك ، كما هو الحال مع شاشات لوحة جيدة ، عادة ما تكتشف شاشات القطرات مركبات المنتج الواحد ، والتي توفر معلومات محدودة في الوظيفة العالمية للمسار المهندس9،10،11.
قد يمكّن تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) من تحديد توصيف أكثر شمولاً لعملية المسار من خلال السماح بتقييم مستويات التعبير لجميع الجينات ذات الصلة في وقت واحد12,13. وعلاوة على ذلك، أساليب قطرة تسمح الآلاف من الخلايا ليتم تعريفها لكل تجربة، وتوفير الإنتاجية اللازمة لفحص المكتبات من المتغيرات المهندسة14،15. ومع ذلك، يتم تحسين أساليب RNA-seq لخلايا الثدييات. الخميرة، على سبيل المقارنة، لديها أقل مرنا لكل خلية وجدار الخلية التي من الصعب إزالة16،مما يمنع تسلسلها بالطرق القائمة. إذا كان يمكن ابتكار طريقة قطرات عالية الإنتاجية لتمكين الخميرة RNA-seq ، فمن شأنه أن يوفر منصة فينومينب قابلة للتطوير وفعالة من حيث التكلفة وغنية بالمعلومات لهندسة الخميرة.
نحن نقدم بروتوكول مفصل من طريقتنا وضعت مؤخرا لتسلسل خلايا الخميرة باستخدام microfluidics قطرات عالية الإنتاجية17. للتغلب على التحدي من الجيش الملكي النيبالي محدودة، ونحن تغليف والثقافة خلايا الخميرة واحد في مجالات هيدروجيل بيكولتر. الثقافة يكرر الخلايا، مما ينتج مئات النسخ تقاسم نفس المسار المهندسة. وهذا يقلل من الاختلاف بسبب التعبير الجيني خلية واحدة في حين زيادة كبيرة في كمية الحمض النووي الريبي المتاحة لتسلسل. بعد التضخيم القائم على الثقافة ، نقوم بتسريع الخلايا ، وإزالة جدار الخلية عن طريق الهضم الأنزيمي السائب. تظل أغشية الخلايا سليمة ، بحيث تظل كل مستعمرة مسببة للتسبب وmRNA المرتبطة بها مغلفة في مجالات الهيدروجيل الخاصة بها. وهذا يسمح لنا لإقران المستعمرات الفردية مع الكواشف التقاط مرنا والعازلة lysis، وmRNA ليتم التقاطها، الباركود، وتسلسل بعد سير عمل قطرة Seq14. لدينا طريقة تسمح النسخ على نطاق واسع فحص الآلاف من مستعمرات الخميرة المسببة للانتشار في كل تجربة.
أسلوبنا لمستعمرة الخميرة isogenic RNA تسلسل (ICO-seq) تتكيف مع نشر خلية واحدة RNA تسلسل منصة، قطرة-Seq، لفحص عالية الإنتاجية من سلالات الخميرة المهندسة. تحتوي خلايا الخميرة على أقل من 10٪ من نسخ مرنا من خلية ثديية نموذجية ولها جدار الخلية التي تحتاج إلى التدهور قبل التقاط مرنا16. هذان العاملان يحولان دون التطبيق المباشر للخميرة على Drop-Seq أو غيرها من منصات scRNA-seq المستندة إلى القطرة. لمعالجة هذه القضايا، ونحن تغليف خلايا واحدة داخل hydrogels ونزرعها في مستعمرات لتوفير ما يكفي من المواد المدخلة لتسلسل الحمض النووي الريبي ونحن هضم جدار خلية الخميرة لتوليد spheroplasts قبل تحلل والتقاط مرنا. تضيف هذه التغييرات تعقيدًا إضافيًا في سير عمل ICO-seq بالمقارنة مع سير عمل Drop-Seq الأصلي وهي خطوات هامة يجب على المستخدمين التأكد من المتابعة بسلاسة.
التشغيل السليم للجهاز A ضروري لتغليف خلايا الخميرة المفردة داخل هيدروجيلات أغاروز. يجب اتباع العد السليم لتعليق الخميرة المدخلات لتقليل عدد من hydrogels مع أكثر من خلية خميرة واحدة، مع ضمان أن تحتوي على ما يكفي من الهيدروجيلات خلية واحدة لضمان كفاءة التقاط الخلية معقولة أثناء التقاط مرنا. أثناء تشغيل الجهاز microfluidic ، يجب أن يكون خليط هلام agarose مذابًا جيدًا ومر عبر فلتر حقنة لتقليل فرصة انسداد الجهاز. خليط هلام agarose هو لزج والمنطقة التي تنقسم قناة واحدة إلى ثمانية عرضة بشكل خاص للانسداد. من خلال توسيط كاميرا عالية السرعة لتصور تشغيل الجهاز في تلك المنطقة من الجهاز ، يمكن للمستخدمين مراقبة توحيد القطرات الناشئة من كل قناة من القنوات الثماني والتفاعل بسرعة إذا تغير التوحيد بسبب القباقيب في أي من القنوات. الفحص من كمية صغيرة من المستحلب التي تم جمعها تحت المجهر يوفر طريقة ثانوية لتأكيد مستحلب عالية الجودة.
بعد نمو مستعمرات الخميرة داخل الهيدروجيلات ، هناك العديد من الاحتياطات اللازمة لضمان جودة استخراج مرنا على مستوى المستعمرة الواحدة. من المهم تحسين الخميرة الوقت في الثقافة الهيدروجيل، لأنه إذا تركت الخميرة في الثقافة لفترة طويلة جدا، وكثير من الهروب من حدود hydrogels، مما يؤدي إلى إشارة خلفية أعلى خلال تسلسل الحمض النووي الريبي وأقل حساسية عند التمييز بين أنواع الخلايا. الجيل السليم من spheroplasts باستخدام Zymolyase يضمن أن يتم الإفراج عن مرنا بعد التعرض للخلايا إلى العازلة حل الخلايا. الفحص البصري لمستعمرات الخميرة التالية Zymolyase يجب أن تسفر عن خلايا الخميرة لامعة. سوف غير لائق هضم جدار الخلية يؤدي إلى انخفاض كفاءة التقاط الحمض النووي الريبي. وأخيراً، ينبغي أن تكون الهيدروجيلات معبأة بشكل وثيق كما يتم حقنها في الجهاز B. رصد مدخلات الهيدروجيل مع كاميرا عالية السرعة سوف تسمح لإنهاء جمع مستحلب مرة واحدة لم يعد هيدروجيلمعبأة قريبة عند إدخال في الجهاز، وإلا فإن كفاءة التقاط تتأثر.
القلق المحتمل مع طريقتنا هو أن ثقافة الميكروجيل من الخميرة قد تغير بشكل كبير التعبير الجيني. العمل السابق التحقيق في التعبير الجيني الخميرة في microgels وعلى أجار تظهر الاختلافات في متوسطات التعبير الجيني ولكن عموما ارتباط إيجابي17، على الرغم من مزيد من التحقيق في هذا الادعاء على مجموعة متنوعة من سلالات الخميرة من الحكمة. الأسلوب لديه أيضا محدودة كفاءة التقاط الخلية بسبب التحميل العشوائي من الخرز التقاط مرنا بعد إحصاءات بواسون14. حاليا حوالي 10٪ من قطرات تحتوي على زى ومستعمرة، ومن المتوقع أن يكون معدل التغليف المزدوج أقل من 1٪. التغليف المزدوج يؤدي إلى عناصر محيرة خلال تحليل البيانات RNA-seq والتصفية لا تزال صعبة23; معدل التقاط 25٪ من شأنه أن يؤدي إلى زيادة مقابلة من التغليف المزدوج إلى 5٪(الشكل التكميلي 2). على الرغم من أننا نظهر ICO-seq باستخدام منصة Drop-Seq ، هناك منصات أخرى دروبليت RNA-seq التي تقدم الخرز التقاط مرنا بشكل قطعي وليس إحصائيًا ، مثل منصة الكروم الجينومية 10x المتاحة تجاريًا15،24. ويمكن أن يعزز دمج هذه المنصات مع ICO-seq كفاءة التقاط ما هو أبعد مما تسمح به إحصاءات بواسون. وأخيراً، فإن القيد الأساسي للقطرة من الحمض النووي الريبي هو عدم القدرة على استعادة خلايا الاهتمام بعد التسلسل. وينبغي أن تؤخذ هذه القيود في الاعتبار عند النظر في أنواع مكتبات الخميرة لتحليل باستخدام هذه الطريقة.
وقد ثبت عدم التجانس من خلية إلى خلية على مستوى البرسيم للميكروبات مثل E. القولونية25 و S. cerevisiae26 الكشف عن خلية جديدة تنص على أن تحليل على مستوى السائبة من شأنه أن يخفي خلاف ذلك. تحليلات الحمض النووي الريبي سق السائبة التي أجريت على C. albicans تميل إما إلى النظر في التغيرات النسخ على نطاق السكان، أو الخلايا البيضاء والشفافة كمجموعتين منفصلتين27،28. ويمكن أن يؤدي تطبيق ICO-seq إلى اكتشاف دول فرعية إضافية وتوفير إطار تحليلي لاكتشاف حالات الخلايا الجديدة داخل أنواع الخميرة الأخرى. ومع ذلك ، فإن نمو الخلايا داخل الهيدروجيللات لا يقتصر على الخميرة: أنواع الخلايا الأخرى ، مثل الثدييات والبكتيرية وغيرها من الخلايا الفطرية يمكن زراعتها أيضًا داخل الهيدروجيلات29،30. تسلسل المستعمرات المسببة للسرطان مقابل الخلايا المفردة يؤدي إلى متوسط الضوضاء البيولوجية بسبب الاختلاف بين الخلايا ، وتحسين التمييز بين أنواع الخلايا. قد يساعد هذا عند تحليل الخلايا حيث يركز التنوع الوراثي على مسارات توليفمحددة. الإمكانيات الموسعة لإدخال نوع الخلية إلى ICO-seq وتكاملها المحتمل مع منصات دروبليت RNA-seq المتاحة تجاريًا يضع ICO-seq كمنصة واعدة لتشريح التغاير الخلوي على المستوى الوراثي.
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا المشروع من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم جائزة الوظيفي DBI-1253293، المعاهد الوطنية للصحة الجديدة مبتكرة جائزة DP2AR068129 ومنح R01HG0008978، والمركز الوطني للعلوم التكنولوجيا منح DBI-1548297، ومركز UCSF للبناء الخلوي. ARA و ZJG هي تشان زوكربيرج بيوهوب المحققين.
0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | Used to make TE-TW buffer |
0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
1 mL syringes | BD | 309628 | |
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | Used to make TE-TW buffer |
27 gauge needles | BD | 305109 | |
3 mL syringes | BD | 309657 | |
3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | See Supplemental Files for 3D print file |
Agarose, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | a9414 | |
Aquapel (hydrophobic glass treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
Drop-Seq Beads | ChemGenes | MACOSKO-2011-10 | |
Glass microscope slides (75 mm x 50 mm) | Corning | 294775X50 | |
Ionic Krytox Surfactant | Synthesis instructions in ref 14. Can substitute with PEG-PFPE surfactant. | ||
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Novec 7500 | 3M | 98-0212-2928-5 | Commonly knowns as HFE 7500 |
PBS | Fisher Scientific | BP243820 | |
PE-2 polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
PEG-PFPE surfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | See Supplemental Files for mask designs |
Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
SSC Buffer | Sigma-Aldrich | S6639 | |
SU-8 2100 | MicroChem | Y111075 | |
SU-8 2150 | MicroChem | Y111077 | |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Krayden | 4019862 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Used to make TE-TW buffer |
YR Digestion buffer | Zymo Research | R1001-1 | Spheroplasting buffer |
YR Lysis Buffer | Zymo Research | R1001-2 | |
Zymolyase | Zymo Research | E1005 | Spheroplasting enzyme mixture |