免疫蛍光を用いたTNBS誘発クローン病を用いたマウスの結腸におけるエストロゲン受容体の可視化
Summary
このプロトコルは、クローン病の完全に検証されたTNBS誘導マウスモデルと、パラフィンに埋め込まれたホルマリン固定結腸切片の免疫蛍光を用いた免疫体化学によるエストロゲン受容体の視覚化方法を提示する。
Abstract
クローン病は炎症性腸疾患の最も診断されたタイプです。腸内で発症する慢性炎症は、蠕動障害および腸粘膜の損傷を引き起こし、結腸新生物の変態のリスクの増加に関連していると思われる。蓄積された証拠は、エストロゲンとエストロゲン受容体がホルモン感受性組織だけでなく、肺や結腸などのエストロゲンに直接関係しない他の組織にも影響を与えることを示しています。ここでは、TNBS誘発クローン病のマウスモデルから得られた結腸におけるエストロゲン受容体の免疫蛍光染色に成功するためのプロトコルについて説明する。マウスおよび腸の準備におけるクローン病の誘導のための詳細なプロトコルと、ホルマリン固定パラフィン埋め込み腸切片を用いたステップバイステップの免疫ヒストリカル手順が提供される。記載された方法は、生体内でのエストロゲン受容体検出およびエストロゲンシグナル伝達の調査に有用であるだけでなく、大腸炎の発症に関与する可能性のある他のタンパク質にも適用することができる。
Introduction
クローン病(CD)は、慢性腸炎として現れる炎症性腸疾患(IBD)である。CDの病因は十分に理解されていないが、腸内微生物叢、食事やストレスなどの遺伝的および環境的要因を含むCDの発達を担っているように見えるいくつかの主要な要因がある1。クローン病の病因をよりよく理解するために、腸の炎症のいくつかのモデルが22、3、4、5、6、73,4,5,6を7使用されています。本稿では、CDの2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)誘導型マウスモデルから得られた結果を提示する。
エストロゲンは慢性腸炎88、9、10、11、129,10,11を調節できることが12文書化されている。エストロゲンの生物学的活性は、コグネイト受容体によって媒介され、その中でも核エストロゲン受容体(ER)、すなわち、ERα(遺伝子ESR1)およびERβ(遺伝子ESR2)、ならびにGタンパク質結合エストロゲン受容体、すなわちG.GPER(遺伝子GPER1)と呼13,ばれる。エストロゲン受容体のレベルを決定するためのいくつかの方法がありますが、腸内でそれらを視覚化するために使用できるのはごくわずかです。
免疫組織化学(IHC)は、フルオロクロム共役抗体を用いた細胞または組織における特定の抗原の検出に関する臨床および基礎研究で広く使用されている方法です。IHCは、組織構造の可視化や特定のタンパク質の同定と局在化において重要な方法であると考えられるため、大腸炎の発症を理解する上で重要な場合があります。ここでは、免疫蛍光を用いた腸内のエストロゲン受容体の免疫物質化学的可視化のための完全かつ検証されたプロトコルを提示する。
Protocol
Representative Results
Discussion
IBD病態生理学検査には、遺伝的、免疫学的または自発的なモデル、ならびに化学的に誘発されたモデル15を含む多数の動物モデルがある。大腸炎のいくつかのタイプの動物モデルの中でも、このプロトコルに記載されているTNBS誘導モデルのような化学的に誘発されたモデルは、比較的安価で入手しやすい。大腸炎のTNBS誘発マウスモデルには、CDの病理学的基礎に関連するい?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ウッチ大学当局の財政支援のおかげで発表されました: 科学研究副学長, 国家と国際協力のための副学長と生物学と環境保護学部の学部長.ダミアン・ジャセニクは、ポーランド国立科学センターからの助成金(2017/24/T/NZ5/00045と2015/N/NZ5/00336)によって支援されました。
Materials
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope – TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome – RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module – EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor – TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
References
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).
- Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).
- Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75 (2), 263-274 (1993).
- Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice. Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).
- Harnish, D. C., et al. Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).
- Pierdominici, M., et al. Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity. Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).
- Włodarczyk, M., et al. G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study. Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).
- Mohammad, I., et al. Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation. Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).
- Jacenik, D., et al. G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn’s disease. Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).
- Prossnitz, E. R., Barton, M. The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease. Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).
- Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling. Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).
- Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. Mouse models for the study of Crohn’s disease. Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).
- Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice. Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).
- Ikeda, M., et al. Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis. Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
