ויזואליזציה של קולטני אסטרוגן נקודותיים של עכברים עם TNBS המושרה מחלת קרוהן באמצעות Immunofluorescence
Summary
הפרוטוקול מציג מודל מאומת TNBS המושרה מלאה של מחלת קרוהן ושיטות עבור ויזואליזציה של קולטני אסטרוגן על ידי אימונוהיסטוכימיה באמצעות immunofluorescence מקטעים נקודתיים קבוע מוטבע פרפין.
Abstract
קרוהן היא הסוג האובחן ביותר של מחלת המעי הדלקתית. דלקת כרונית המתפתחת במעי מוביל להפרעה הפריסטלזיס ולנזק של רירית המעי ונראה להיות משויך לסיכון מוגבר של שינוי המעי הגס הנאופלסטי. צבירת ראיות עולה כי אסטרוגנים וקולטנים אסטרוגן להשפיע לא רק רקמות הורמונלי רגיש, אלא גם רקמות אחרות לא קשור ישירות אסטרוגנים, כגון הריאות או המעי הגס. כאן, אנו מתארים את הפרוטוקול לצביעת החיסונית מוצלחת של קולטני אסטרוגן במעי הגס המתקבל ממודל murine של מחלת קרוהן המושרה. פרוטוקול מפורט אינדוקציה של מחלת קרוהן בעכברים והכנה למעיים מסופק, כמו גם צעד אחר צעד אימונוהיסטוכימיקלים הליך באמצעות formalin קבוע-מקטעים המעי מוטבע. השיטות שתוארו הם לא רק שימושי לזיהוי קולטן אסטרוגן החקירה איתות אסטרוגן ב vivo אבל יכול גם להיות מיושם על חלבונים אחרים אשר עשויים להיות מעורבים בפיתוח של קוליטיס.
Introduction
קרוהן (CD) היא מחלת מעיים דלקתית (IBD) הנראית כמו דלקת המעי כרונית. האטיולוגיה של תקליטור הוא הבין בצורה גרועה, אבל יש כמה גורמים עיקריים שנראים להיות אחראי על פיתוח תקליטורים, כולל microbiota המעי, וגורמים גנטיים וסביבתיים, כגון דיאטה או מתח1. להבנה טובה יותר של הפתוגנזה של מחלת קרוהן, מודלים שונים של דלקת במעיים שימשו2,3,4,5,6,7. במאמר זה, אנו מציגים את התוצאות שהתקבלו מ 2, 4, 6-trinitrobenzene נזן חומצה sulfonic (TNBS)-מודל murine המושרה של תקליטור.
זה תועד כי אסטרוגנים מסוגלים למודולט דלקת מעיים כרונית8,9,10,11,12. הפעילות הביולוגית של אסטרוגנים מתווכת על ידי קולטנים קנצוני, ביניהם הם קולטני אסטרוגן גרעיני (ERs), כלומר, erα (ג ‘ ין ESR1) ו ERβ (גנים ESR2), כמו גם G חלבון מצמידים קולטן אסטרוגן, כלומר, gper (גנים GPER1), המכונה ממברנה מאוגד ER13,14. ישנן מספר שיטות לקביעת רמת קולטני אסטרוגן, אבל רק מעטים יכולים לשמש כדי להמחיש אותם במעי.
אימונוהיסטוכימיה (IHC) היא שיטה נפוצה במחקרים קליניים ובסיסיים לאיתור אנטיגנים מסוימים בתאים או ברקמות עם נוגדנים מצוונים fluorochrome. IHC נראה שיטה חשובה הדמיית מבנה רקמות, כמו גם זיהוי ולוקליזציה של חלבונים ספציפיים, אשר עשוי להיות קריטי להבנת ההתפתחות של קוליטיס. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מלא ומאומת עבור הדמיה אימונוהיסטוכימיה של קולטני אסטרוגן במעי באמצעות immunofluorescence.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מודלים רבים של בעלי חיים עבור בדיקה פתופסולוגיה IBD, כולל גנטי, מודלים אימונולוגיים או ספונטנית, כמו גם דגמים המושרה כימית15. בין מספר סוגים של מודלים בעלי חיים של קוליטיס, כימית המושרה מודלים כגון מודל TNBS המושרה המתואר בפרוטוקול זה, הם זולים יחסית וקל להשיג. המודל המושרה TNBS …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה פורסמה בזכות התמיכה הכספית של הרשויות באוניברסיטת לודז ‘: סגן הרקטור למחקר מדעי, סגן הרקטור לשיתוף פעולה לאומי ובינלאומי ודיקן הפקולטה לביולוגיה והגנת הסביבה. דמיאן ז’זניק נתמך על ידי מענקים (2017/24/T/NZ5/00045 ו-2015/17/N/NZ5/00336) מהמרכז הלאומי למדעים, פולין.
Materials
| Animals | |||
| BALB/C mice | University of Lodz | NA | |
| Equipment | |||
| Caliper | VWR | 62379-531 | |
| Cardboard block | NA | NA | |
| Confocal microscope – TCS SP8 | Leica Biosystems | NA | |
| Fully automated rotary microtome – RM2255 | Leica Biosystems | NA | |
| Glass slide | Thermo Scientific | J1800BMNT | |
| Heated Paraffin Embedding Module – EG1150 H | Leica Biosystems | NA | |
| Histological box | Marfour | LN.138747 | |
| Hydrophobic pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
| Laboratory balance | Radwag | WL-104-0048 | |
| LAS X software | Leica Biosystems | NA | |
| Metal mold | Marfour | CP.5105 | |
| Sterile gauze | NA | NA | |
| Sterile scissor | NA | NA | |
| Sterile tweezer | NA | NA | |
| Tissue processor – TP1020 | Leica Biosystems | NA | |
| Reagents | |||
| 2, 4, 6-trinitrobenzene sulfonic acid | Sigma-Aldrich | 92822 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DiOC6 (3) | Sigma-Aldrich | 318426 | |
| DyLight 650 secondary antibody | Abcam | ab96886 | |
| ERα primary antibody | Abcam | ab75635 | |
| ERβ primary antibody | Abcam | ab3576 | |
| Ethanol | Avantor Performance Materials Poland | 396480111 | |
| Formaldehyde | Avantor Performance Materials Poland | 432173111 | |
| GPER primary antibody | Abcam | ab39742 | |
| Hydrochloric acid | Avantor Performance Materials Poland | 575283421 | |
| Hydrogen peroxidase | Avantor Performance Materials Poland | 885193111 | |
| isoflurane (forane) | Baxter | 1001936040 | |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
| Paraffin | Leica Biosystems | 39602012 | |
| Petrie dish | Nest Scientific | 705001 | |
| Phosphate buffer saline | Sigma-Aldrich | P3813 | |
| Physiological saline | Sigma-Aldrich | 7982 | |
| Primocin (antibiotic) | Invitrogen | ant-pm-1 | |
| ProLong Diamond Antifage Mountant with DAPI (glycerol-based liquid with DAPI) | Invitrogen | P36971 | |
| Sodium chloride | Chempur | WE/231-598-3 | |
| Sodium citrate | Avantor Performance Materials Poland | 795780429 | |
| Tris | Avantor Performance Materials Poland | 853470115 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Xylene | Avantor Performance Materials Poland | BA0860119 |
References
- Zhang, Y. Z., Li, Y. Y. Inflammatory bowel disease: pathogenesis. World Journal of Gastroenterology. 20 (1), 91-99 (2014).
- Morris, G. P., et al. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Okayasu, I., et al. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice. Gastroenterology. 98 (3), 694-702 (1990).
- Boirivant, M., Fuss, I. J., Chu, A., Strober, W. Oxazolone colitis: a murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4. Journal of Experimental Medicine. 188 (10), 1929-1939 (1998).
- Morrissey, P. J., Charrier, K., Braddy, S., Liggitt, D., Watson, J. D. CD4+ T cells that express high levels of CD45RB induce wasting disease when transferred into congenic severe combined immunodeficient mice. Disease development is prevented by cotransfer of purified CD4+ T cells. Journal of Experimental Medicine. 178 (1), 237-244 (1993).
- Kühn, R., Löhler, J., Rennick, D., Rajewsky, K., Müller, W. Interleukin-10-deficient mice develop chronic enterocolitis. Cell. 75 (2), 263-274 (1993).
- Sundberg, J. P., Elson, C. O., Bedigian, H., Birkenmeier, E. H. Spontaneous, heritable colitis in a new substrain of C3H/HeJ mice. Gastroenterology. 107 (6), 1726-1735 (1994).
- Harnish, D. C., et al. Beneficial effects of estrogen treatment in the HLA-B27 transgenic rat model of inflammatory bowel disease. American Journal of Physiology Gastrointestinal and Liver Physiology. 286 (1), 118-125 (2004).
- Pierdominici, M., et al. Linking estrogen receptor β expression with inflammatory bowel disease activity. Oncotarget. 6 (38), 40443-40451 (2015).
- Włodarczyk, M., et al. G protein-coupled receptor 30 (GPR30) expression pattern in inflammatory bowel disease patients suggests its key role in the inflammatory process. A preliminary study. Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases. 26 (1), 29-35 (2017).
- Mohammad, I., et al. Estrogen receptor α contributes to T cell-mediated autoimmune inflammation by promoting T cell activation and proliferation. Science Signaling. 11 (526), eaap9415 (2018).
- Jacenik, D., et al. G protein-coupled estrogen receptor mediates anti-inflammatory action in Crohn’s disease. Scientific Reports. 9 (1), 6749 (2019).
- Prossnitz, E. R., Barton, M. The G protein-coupled estrogen receptor GPER in health and disease. Nature Review Endocrinology. 7 (12), 715-726 (2011).
- Yaşar, P., Ayaz, G., User, S. D., Güpür, G., Muyan, M. Molecular mechanisms of estrogen-estrogen receptor signaling. Reproductive Medicine and Biology. 16 (1), 4-20 (2016).
- Pizarro, T. T., Arseneau, K. O., Bamias, G., Cominelli, F. Mouse models for the study of Crohn’s disease. Trends in Molecular Medicine. 9 (5), 218-222 (2003).
- Neurath, M. F., Fuss, I., Kelsall, B. L., Stüber, E., Strober, W. Antibodies to interleukin 12 abrogate established experimental colitis in mice. Journal of Experimental Medicine. 182 (5), 1281-1290 (1995).
- Ikeda, M., et al. Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis, but not oxazalone-induced colitis. Digestive Diseases and Sciences. 53 (7), 1869-1875 (2007).
- Thavarajah, R., Mudimbaimannar, V. K., Elizabeth, J., Rao, U. K., Ranganathan, K. Chemical and physical basics of routine formaldehyde fixation. Journal of Oral Maxillofacial Pathology. 16 (3), 400-405 (2012).
