Summary

Долгосрочный Channelrhodopsin-помощь цепи Картирование Нижнего Колликулнейроннейроны с синим и красным сдвинутым Channelrhodopsins

Published: February 07, 2020
doi:

Summary

Channelrhodopsin-assisted circuit mapping (CRACM) является точным методом для функционального картирования проекций нейронов дальнего радиуса действия между анатомически и/или генетически идентифицированными группами нейронов. Здесь мы описываем, как использовать CRACM для картирования слуховых соединений ствола мозга, включая использование красного сдвига опсина, ChrimsonR.

Abstract

При исследовании нейронных цепей, стандартное ограничение подхода зажима зажима in vitro что аксоны от множественных источников часто смешаны, делая его трудным изолировать входы от индивидуальных источников с электрической стимуляцией. Однако, с помощью каналаrhodopsin помощь схемы картирования (CRACM), это ограничение теперь может быть преодолено. Здесь мы сообщаем о методе использования CRACM для картирования восходящих входов от нижних слуховых ядер ствола мозга и коммистуральных входов к идентифицированному классу нейронов в нижнем колликуле (IC), ядре среднего мозга слуховой системы. В IC, местные, комиссионерские, восходящие и нисходящие аксоны сильно переплетены и поэтому неотличимы с электрической стимуляцией. Путем впрыскивания вирусной конструкции для того чтобы управлять выражением channelrhodopsin в presynaptic ядре, последовано заработка зажима зажима для того чтобы охарактеризовать присутсвие и физиологию channelrhodopsin-выражая синаптические входы, прогнозы от специфического источника к определенной популяции нейронов IC можно отображать с точностью типа клетки. Мы показываем, что этот подход работает как с Chronos, синий свет активированный каналrhodopsin, и ChrimsonR, красный сдвиг channelrhodopsin. В отличие от предыдущих докладов с передних мозгов, мы находим, что ChrimsonR надежно проданы вниз аксоны дорсального кохлеарного ядра основных нейронов, указывая, что ChrimsonR может быть полезным инструментом для экспериментов CRACM в стволе мозга. Представленный здесь протокол включает в себя подробные описания хирургии инъекций внутричерепного вируса, включая стереотаксические координаты для таргетинга инъекций в рстное кохлеарное ядро и IC мышей, а также как комбинировать запись зажима цельного клеточного зажима с активацией channelrhodopsin для исследования дальних проекций на IC нейронов. Хотя этот протокол адаптирован для характеристики слуховых входов в IC, он может быть легко адаптирован для изучения других долгосрочных прогнозов в слуховом стволе мозга и за его пределами.

Introduction

Синаптические связи имеют решающее значение для нейронной цепи функции, но точная топология и физиология синапсов в нейронных цепей часто трудно зондировать экспериментально. Это потому, что электрическая стимуляция, традиционный инструмент клеточной электрофизиологии, без разбора активирует аксоны вблизи места стимуляции, и в большинстве областей мозга, аксоны из различных источников (местные, восходящие, и / или нисходящие) переплетаются. Однако, с помощью channelrhodopsin помощь схемы картирования (CRACM)1,2, это ограничение теперь можно преодолеть3. Channelrhodopsin (ChR2) является свет активирован, катиционно-селективный ионный канал, первоначально найденный в зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 может быть активирован синим светом длины волны около 450-490 нм, деполяризовать клетку через приток катиона. ChR2 был впервые описан и выражен в ооцитах Xenopus Нагелем и коллегами4. Вскоре после этого, Бойден и его коллеги5 выразили ChR2 в нейронах млекопитающих и показали, что они могут использовать световые импульсы, чтобы надежно контролировать пики на миллисекундный тайм-масштаб, вызывая потенциалдействия 10 мс после активации ChR2 с синим светом. Оптогенетические каналы с еще более быстрой кинетикой были найдены в последнее время (например, Chronos6).

Основной подход к эксперименту CRACM заключается в том, чтобы трансфектировать популяцию пресинаптических нейронов с рекомбинантным адено-ассоциированным вирусом (RAAV), который несет генетическую информацию для канала. Трансфекция нейронов с РААВ приводит к выражению закодированного каналародопсин. Как правило, channelrhodopsin помечены флуоресцентным белком, как GFP (Зеленый флуоресцентный белок) или tdTomato (красный флуоресцентный белок), так что трансфекция нейронов в целевой области может быть легко подтверждена с флуоресценции изображений. Поскольку RAAVs не патогенные, имеют низкий воспалительный потенциал и длительное выражениегена7,8, они стали стандартной техникой для доставки channelrhodopsins к нейронам. Если после трансфекции пресинаптической популяции нейронов активация канала через вспышки света вызывает постсинаптические потенциалы или токи в целевых нейронах, это свидетельствует о аксональной связи от трансинфицированного ядра к записанной клетке. Потому что разорванные аксоны в экспериментах ломтик мозга могут быть обусловлены выпустить нейромедиатор через активации channelrhodopsin, ядра, которые лежат за пределами острого ломтика, но отправить аксоны в постсинаптической области мозга могут быть определены с CRACM. Сила этого метода заключается в том, что связь и физиология выявленных синаптических входов дальнего радиуса действия могут быть непосредственно исследованы.

В дополнение к channelrhodopsins, которые возбудимы синим светом, следователи недавно определили несколько красных сдвига channelrhodopsins9,10, в том числе Chrimson и его быстрее аналог ChrimsonR, оба из которых возбуждены с красным светом 6. Красный сдвиг opsins представляют интерес, потому что красный свет проникает ткани лучше, чем синий свет, и красный свет может иметь более низкую цитотоксичность, чем синий свет10,11,12. Красно-сдвигаемые каналродопсины также открывают возможность двухцветных экспериментов CRACM, где сближение аксонов из разных ядер на одном и том же нейроне может быть проверено в одном эксперименте6,13,14. Тем не менее, текущие красно-сдвигаемые опсины часто демонстрируют нежелательные перекрестные активации с синим светом15,16,17, что затрудняет два цветных эксперимента. Кроме того, некоторые сообщения показали, что ChrimsonR подвергается ограниченной аксональной торговли, что может сделать его сложным использовать ChrimsonR для экспериментов CRACM16,17.

Почти все восходящие проекции из нижних слуховых ядер ствола сходятся в нижнем колликуле (IC), центре среднего мозга центрального слухового пути. Это включает в себя прогнозы из кохлеарного ядра (CN)18,19, большинство из превосходного оливари комплекса (SOC)20, и дорсальный (DNLL) и вентрал (VNLL) ядра бокового лемниска21. Кроме того, большая нисходящая проекция от слуховой коры заканчивается в IC18,19,20,21,22,и IC нейроны сами синапсы широко в пределах местных и контралатеральных долей IC23. Смешение аксонов из многих источников затрудняет зондирование IC схем с помощью электрической стимуляции24. В результате, даже несмотря на то, что нейроны в IC выполняют вычисления, важные для локализации звука и идентификации речевых и других коммуникационных звуков25,26,организация нейронных цепей в ИК в значительной степени неизвестна. Недавно мы определили VIP нейронов в качестве первого молекулярно идентифицируемого класса нейронов в IC27. VIP нейроны являются глутаматергических нейронов стеллата, которые проектируют на несколько дальних целей, в том числе слуховой таламус и превосходный колликул. Теперь мы можем определить источники и функции локальных и дальних входов в VIP-нейроны и определить, как эти соединения цепи способствуют обработке звука.

Протокол, представленный здесь, с учетом расследования синаптических входов в VIP-нейронов в IC мышей, в частности, от контралатерального IC и DCN (Рисунок 1). Протокол может быть легко адаптирован к различным источникам ввода, другой тип нейронов или другой области мозга в целом. Мы также показываем, что ChrimsonR является эффективным красным сдвигом channelrhodopsin для дальнего диапазона отображения в слуховом стволе мозга. Тем не менее, мы демонстрируем, что ChrimsonR сильно активируется синим светом, даже при низкой интенсивности, и, таким образом, чтобы объединить ChrimsonR с Chronos в двухцветных экспериментах CRACM, тщательный контроль должен быть использован для предотвращения перекрестной активации ChrimsonR.

Protocol

Получить одобрение от местного Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) и придерживаться руководящих принципов NIH для ухода и использования лабораторных животных. Все процедуры в этом протоколе были одобрены IACUC Мичиганского университета и были в соответств…

Representative Results

Мы пересекли VIP-IRES-Cre мышей(Viptm1 (cre) JH/J) и Ai14 Cre-репортер мышей (B6. Cg-Gt (ROSA)26Sortm14 (CAG-tdTomato)Hze/J) для генерации потомства F1, в котором VIP нейроны выражают флуоресцентный белок tdTomato. F1 потомство обоих полов были использованы, в возрасте послеродового дня (P) 21 до …

Discussion

Мы обнаружили, что CRACM является мощным методом для выявления и характеристики синаптических входов дальнего радиуса действия в нейроны мыши IC. Следуя описанному здесь протоколу, мы добились надежной трансфекции нейронов в DCN и IC, а также надежной аксональной торговли Chronos и ChrimsonR синапт?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft научно-исследовательской стипендии (GO 3060/1-1, проект номер 401540516, в ГД) и Национальные институты здравоохранения грант R56 DC016880 (MTR).

Materials

AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH Addgene 59171-AAV1
AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH Addgene 59170-AAV1
Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) Jackson Laboratory stock #007914
Amber (590nm) LUXEON Rebel LED Luxeon Star LEDs SP-01-A8
Blue (470nm) LUXEON Rebel LED Luxeon Star LEDs SP-01-B4
Carproject (carprofen) Henry Schein Animal Health 59149
Drummond glas capillaries Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X
Drummond Nanoject 3 Drummond Scientific Company 3-300-207
Electrode beveler Sutter Instrument FG-BV10-D
Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures Ethicon local pharmacy
Fixed stage microscope any n/a
Gas anesthesia head holder David Kopf Instruments 933-B
General surgery tools Fine Science Tools N/A
Golden A5 pet clipper Oster 078005-010-003
Heating pad Custom build N/A
Hooded induction chamber w/ vacuum system Patterson Scientific 78917760
Hot bead sterilizer Steri 250 Inotech IS-250
Iodine solution 10% MedChoice local pharmacy
Isoflurane vaporizer Patterson Scientific 07-8703592
Lidocain topical jelly 2% Akorn local pharmacy
Micro motor drill 1050 Henry Schein Animal Health 7094351
Micro motor drill bits 0.5 mm Fine Science Tools 19007-05
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument MP-285/R
Ophthalmic ointment Artificial Tears Akorn local pharmacy
P-1000 electrode puller Sutter Instrument P-1000
Patch clamp amplifier incl data acquisition software any n/a
Portable anethesia machine Patterson Scientific 07-8914724
Small animal steroetaxic frame David Kopf Instruments 930-B
Standard chemicals local vendors N/A
standard imaging solutions
Sterile towel drapes Dynarex 4410
Surgical marker Fine Science Tools 18000-30
Temperature controller Custom build N/A
Vibratome any n/a
VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) Jackson Laboratory stock #010908
Water bath any n/a

References

  1. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).
  2. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping. Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
  3. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
  4. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).
  5. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  6. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11, 338-346 (2014).
  7. Flotte, T. R. Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).
  8. Aponte-Ubillus, J. J., et al. Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production. Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).
  9. Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13, 325-328 (2016).
  10. Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).
  11. Mager, T., et al. High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics. Nature Communications. 9, (2018).
  12. Oda, K., et al. Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson. Nature Communications. 9, (2018).
  13. Hooks, B. M. Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations. Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).
  14. Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. 遗传学. 200, 1029-1034 (2015).
  15. Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience. Neuron. 96, 572-603 (2017).
  16. Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation. Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).
  17. Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  18. Oliver, D. L. Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study. Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).
  19. Oliver, D. L. Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction. Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).
  20. Glendenning, K. K., Masterton, R. B. Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive. Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).
  21. Adams, J. C. Ascending projections to the inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).
  22. Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).
  23. Saldaña, E., Merchań, M. A. Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).
  24. Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  25. Felix, R. A., Gourévitch, B., Portfors, C. V. Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders. Hearing Research. 362, 48-60 (2018).
  26. Winer, J. A., Schreiner, C., Winer, J. A., Schreiner, C., et al. . The inferior colliculus: with 168 illustrations. , (2005).
  27. Goyer, D., et al. A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice. eLife. 8, e43770 (2019).

Play Video

Cite This Article
Goyer, D., Roberts, M. T. Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins. J. Vis. Exp. (156), e60760, doi:10.3791/60760 (2020).

View Video