Долгосрочный Channelrhodopsin-помощь цепи Картирование Нижнего Колликулнейроннейроны с синим и красным сдвинутым Channelrhodopsins

Синаптические связи имеют решающее значение для нейронной цепи функции, но точная топология и физиология синапсов в нейронных цепей часто трудно зондировать экспериментально. Это потому, что электрическая стимуляция, традиционный инструмент клеточной электрофизиологии, без разбора активирует аксоны вблизи места стимуляции, и в большинстве областей мозга, аксоны из различных источников (местные, восходящие, и / или нисходящие) переплетаются. Однако, с помощью channelrhodopsin помощь схемы картирования (CRACM)^1,2, это ограничение теперь можно преодолеть³. Channelrhodopsin (ChR2) является свет активирован, катиционно-селективный ионный канал, первоначально найденный в зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 может быть активирован синим светом длины волны около 450-490 нм, деполяризовать клетку через приток катиона. ChR2 был впервые описан и выражен в ооцитах Xenopus Нагелем и коллегами⁴. Вскоре после этого, Бойден и его коллеги⁵ выразили ChR2 в нейронах млекопитающих и показали, что они могут использовать световые импульсы, чтобы надежно контролировать пики на миллисекундный тайм-масштаб, вызывая потенциалдействия 10 мс после активации ChR2 с синим светом. Оптогенетические каналы с еще более быстрой кинетикой были найдены в последнее время (например, Chronos⁶).

Основной подход к эксперименту CRACM заключается в том, чтобы трансфектировать популяцию пресинаптических нейронов с рекомбинантным адено-ассоциированным вирусом (RAAV), который несет генетическую информацию для канала. Трансфекция нейронов с РААВ приводит к выражению закодированного каналародопсин. Как правило, channelrhodopsin помечены флуоресцентным белком, как GFP (Зеленый флуоресцентный белок) или tdTomato (красный флуоресцентный белок), так что трансфекция нейронов в целевой области может быть легко подтверждена с флуоресценции изображений. Поскольку RAAVs не патогенные, имеют низкий воспалительный потенциал и длительное выражение^гена7,8, они стали стандартной техникой для доставки channelrhodopsins к нейронам. Если после трансфекции пресинаптической популяции нейронов активация канала через вспышки света вызывает постсинаптические потенциалы или токи в целевых нейронах, это свидетельствует о аксональной связи от трансинфицированного ядра к записанной клетке. Потому что разорванные аксоны в экспериментах ломтик мозга могут быть обусловлены выпустить нейромедиатор через активации channelrhodopsin, ядра, которые лежат за пределами острого ломтика, но отправить аксоны в постсинаптической области мозга могут быть определены с CRACM. Сила этого метода заключается в том, что связь и физиология выявленных синаптических входов дальнего радиуса действия могут быть непосредственно исследованы.

В дополнение к channelrhodopsins, которые возбудимы синим светом, следователи недавно определили несколько красных сдвига channelrhodopsins^9,10, в том числе Chrimson и его быстрее аналог ChrimsonR, оба из которых возбуждены с красным светом 6^. Красный сдвиг opsins представляют интерес, потому что красный свет проникает ткани лучше, чем синий свет, и красный свет может иметь более низкую цитотоксичность, чем синий свет^10,11,12. Красно-сдвигаемые каналродопсины также открывают возможность двухцветных экспериментов CRACM, где сближение аксонов из разных ядер на одном и том же нейроне может быть проверено в одном эксперименте^6,13,14. Тем не менее, текущие красно-сдвигаемые опсины часто демонстрируют нежелательные перекрестные активации с синим светом^15,16,17, что затрудняет два цветных эксперимента. Кроме того, некоторые сообщения показали, что ChrimsonR подвергается ограниченной аксональной торговли, что может сделать его сложным использовать ChrimsonR для экспериментов CRACM^16,17.

Почти все восходящие проекции из нижних слуховых ядер ствола сходятся в нижнем колликуле (IC), центре среднего мозга центрального слухового пути. Это включает в себя прогнозы из кохлеарного ядра (CN)^18,19, большинство из превосходного оливари комплекса (SOC)²⁰, и дорсальный (DNLL) и вентрал (VNLL) ядра бокового лемниска²¹. Кроме того, большая нисходящая проекция от слуховой коры заканчивается в IC^{18,19,20,21,22,}и IC нейроны сами синапсы широко в пределах местных и контралатеральных долей IC²³. Смешение аксонов из многих источников затрудняет зондирование IC схем с помощью электрической стимуляции^24. В результате, даже несмотря на то, что нейроны в IC выполняют вычисления, важные для локализации звука и идентификации речевых и других коммуникационных звуков^25,26,организация нейронных цепей в ИК в значительной степени неизвестна. Недавно мы определили VIP нейронов в качестве первого молекулярно идентифицируемого класса нейронов в IC²⁷. VIP нейроны являются глутаматергических нейронов стеллата, которые проектируют на несколько дальних целей, в том числе слуховой таламус и превосходный колликул. Теперь мы можем определить источники и функции локальных и дальних входов в VIP-нейроны и определить, как эти соединения цепи способствуют обработке звука.

Протокол, представленный здесь, с учетом расследования синаптических входов в VIP-нейронов в IC мышей, в частности, от контралатерального IC и DCN (Рисунок 1). Протокол может быть легко адаптирован к различным источникам ввода, другой тип нейронов или другой области мозга в целом. Мы также показываем, что ChrimsonR является эффективным красным сдвигом channelrhodopsin для дальнего диапазона отображения в слуховом стволе мозга. Тем не менее, мы демонстрируем, что ChrimsonR сильно активируется синим светом, даже при низкой интенсивности, и, таким образом, чтобы объединить ChrimsonR с Chronos в двухцветных экспериментах CRACM, тщательный контроль должен быть использован для предотвращения перекрестной активации ChrimsonR.