Summary

Lange afstand Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping van inferieure Colliculus Neuronen met blauwe en rood-verschoven Channelrhodopsinen

Published: February 07, 2020
doi:

Summary

Channelrhodopsin-assisted circuit mapping (CRACM) is een precisietechniek voor het functioneel in kaart brengen van lange afstandneuronale projecties tussen anatomische en/of genetisch geïdentificeerde groepen neuronen. Hier beschrijven we hoe we CRACM kunnen gebruiken om auditieve hersenstamverbindingen in kaart te brengen, inclusief het gebruik van een roodverschoven opsin, ChrimsonR.

Abstract

Bij het onderzoeken van neurale circuits, een standaard beperking van de in vitro patch klem aanpak is dat axonen uit meerdere bronnen zijn vaak gemengd, waardoor het moeilijk is om ingangen te isoleren van individuele bronnen met elektrische stimulatie. Echter, met behulp van channelrhodopsin assisted circuit mapping (CRACM), kan deze beperking nu worden overwonnen. Hier rapporteren we een methode om CRACM te gebruiken om opgaande ingangen van lagere auditieve hersenstamkernen en commissurale ingangen in kaart te brengen naar een geïdentificeerde klasse neuronen in de inferieure colliculus (IC), de midbrainkern van het auditieve systeem. In de IC zijn lokale, commissurale, opgaande en dalende axonen sterk met elkaar verweven en daardoor niet te onderscheiden met elektrische stimulatie. Door het injecteren van een virale constructie om expressie van een channelrhodopsine in een presynaptische kern te stimuleren, gevolgd door patch klem opname om de aanwezigheid en fysiologie van channelrhodopsin-uitdrukkende synaptische ingangen te karakteriseren, projecties van een specifieke bron aan een specifieke populatie ic-neuronen kan worden toegewezen met celtype-specifieke nauwkeurigheid. We laten zien dat deze aanpak werkt met zowel Chronos, een blauw licht geactiveerde kanaalrhodopsine, als ChrimsonR, een rood verschoven kanaalrhodopsine. In tegenstelling tot eerdere rapporten van het voorbrein, vinden we dat ChrimsonR robuust wordt verhandeld door de axonen van dorsale cochleair nucleus principal neuronen, wat aangeeft dat ChrimsonR een nuttig hulpmiddel kan zijn voor CRACM-experimenten in de hersenstam. Het hier gepresenteerde protocol bevat gedetailleerde beschrijvingen van de intracraniële virusinjectiechirurgie, inclusief stereotaxiccoördinaten voor het richten van injecties op de rugslakkenkern en IC van muizen, en hoe hele celpatchklemregistratie te combineren met channelrhodopsine activering om lange-afstandsprojecties aan IC neuronen te onderzoeken. Hoewel dit protocol is afgestemd op het karakteriseren van auditieve ingangen aan de IC, kan het gemakkelijk worden aangepast om andere lange-afstandsprojecties in de auditieve hersenstam en daarbuiten te onderzoeken.

Introduction

Synaptische verbindingen zijn van cruciaal belang voor neurale circuitfunctie, maar de precieze topologie en fysiologie van synapsen binnen neurale circuits zijn vaak moeilijk experimenteel te onderzoeken. Dit komt omdat elektrische stimulatie, het traditionele instrument van cellulaire elektrofysiologie, lukraak axonen activeert in de buurt van de stimulatiesite, en in de meeste hersengebieden verstrengelen axonen uit verschillende bronnen (lokaal, oplopend en/of dalend). Echter, met behulp van channelrhodopsin assisted circuit mapping (CRACM)1,2, kan deze beperking nu worden overwonnen3. Channelrhodopsine (ChR2) is een licht geactiveerd, kation-selectieve ionenkanaal oorspronkelijk gevonden in de groene alg Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 kan worden geactiveerd door blauw licht van een golflengte rond 450-490 nm, depolariseren van de cel door middel van kation instroom. ChR2 werd voor het eerst beschreven en uitgedrukt in Xenopus eicellen door Nagel en collega’s4. Kort daarna, Boyden en collega’s5 uitgedrukt ChR2 in zoogdierneuronen en toonde aan dat ze lichtpulsen konden gebruiken om betrouwbaar controle spiking op een milliseconde tijdschaal, inducerende actie potentials ~ 10 ms na activering van ChR2 met blauw licht. Optogenetische kanalen met nog snellere kinetiek zijn onlangs gevonden (bijvoorbeeld Chronos6).

De basisbenadering van een CRACM-experiment is om een populatie van vermeende presynaptische neuronen te transfectmet een recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) dat de genetische informatie voor een channelrhodopsine draagt. Transfection van neuronen met rAAV leidt tot de expressie van de gecodeerde channelrhodopsine. Typisch, de channelrhodopsine is gelabeld met een fluorescerend eiwit zoals GFP (Green Fluorescent Protein) of tdTomato (een rood fluorescerend eiwit), zodat transfection van neuronen in het doelgebied gemakkelijk kan worden bevestigd met fluorescentie beeldvorming. Omdat rAAVs niet-pathogene zijn, een laag ontstekingspotentieel hebben en langdurige genexpressie7,8, zijn ze een standaardtechniek geworden om channelrhodopsinen aan neuronen te leveren. Als, na transfection van een vermeende presynaptische populatie van neuronen, activering van een channelrhodopsine door middel van lichtflitsen lokt postsynaptische potentialen of stromingen in de doelneuronen, dit is het bewijs van een axonale verbinding van de transfected kern naar de geregistreerde cel. Omdat afgehakte axonen in hersenslice experimenten kunnen worden gedreven om neurotransmitter release door middel van channelrhodopsine activering, kernen die buiten de acute slice liggen, maar stuur axonen in de postsynaptische hersengebied kan worden geïdentificeerd met CRACM. De kracht van deze techniek is dat de connectiviteit en fysiologie van geïdentificeerde synaptische ingangen over lange afstand direct kunnen worden onderzocht.

In aanvulling op channelrhodopsins die prikkelbaar zijn door blauw licht, onderzoekers hebben onlangs geïdentificeerd verschillende rood-verschoven channelrhodopsins9,10, met inbegrip van Chrimson en zijn snellere analoge ChrimsonR, die beide zijn enthousiast met rood licht van ~ 660 nm6. Roodverschoven opsinen zijn van belang omdat rood licht weefsel beter doordringt dan blauw licht, en rood licht kan een lagere cytotoxiciteit hebben dan blauw licht10,11,12. Rood verschoven channelrhodopsinen openen ook de mogelijkheid van dual color CRACM experimenten, waarbij de convergentie van axonen uit verschillende kernen op hetzelfde neuron kan worden getest in een experiment6,13,14. Echter, de huidige rood-verschoven opsins vertonen vaak ongewenste kruisactivering met blauw licht15,16,17, waardoor twee kleur experimenten moeilijk. Bovendien hebben sommige rapporten aangegeven dat ChrimsonR beperkte axonale handel ondergaat, wat het moeilijk kan maken om ChrimsonR te gebruiken voor CRACM-experimenten16,17.

Bijna alle opgaande projecties van de lagere auditieve hersenstamkernen komen samen in de inferieure colliculus (IC), de midbrain hub van de centrale auditieve route. Dit omvat projecties van de cochleaire kern (CN)18,19, het grootste deel van het superieure olivariecomplex (SOC)20, en de dorsale (DNLL) en ventrale (VNLL) kernen van de laterale lemniscus21. Bovendien eindigt een grote dalende projectie van de auditieve cortex in de IC18,19,20,21,22, en IC-neuronen zelf synaps breed binnen de lokale en contralaterale kwabben van de IC23. Het vermengen van axonen uit vele bronnen heeft het moeilijk gemaakt om IC-circuits te sondemeten met behulp van elektrische stimulatie24. Als gevolg daarvan, hoewel neuronen in de IC berekeningen uit te voeren belangrijk voor geluidslokalisatie en de identificatie van spraak en andere communicatie geluiden25,26, de organisatie van neurale circuits in de IC is grotendeels onbekend. We hebben onlangs geïdentificeerd VIP neuronen als de eerste moleculair identificeerbare neuron klasse in de IC27. VIP-neuronen zijn glutamatergic stellate neuronen die projecteren op verschillende lange-afstandsdoelen, waaronder de auditieve thalamus en superieure colliculus. We zijn nu in staat om de bronnen en functie van lokale en lange-afstandsingangen voor VIP-neuronen te bepalen en te bepalen hoe deze circuitverbindingen bijdragen aan geluidsverwerking.

Het hier gepresenteerde protocol is afgestemd op het onderzoeken van synaptische ingangen van VIP-neuronen in de IC van muizen, met name van de contralaterale IC en de DCN (Figuur 1). Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan verschillende bronnen van input, een ander neuron type of een ander hersengebied helemaal. We laten ook zien dat ChrimsonR een effectieve roodverschoven kanaalrhodopsine is voor lange afstand circuit mapping in de auditieve hersenstam. We tonen echter aan dat ChrimsonR sterk wordt geactiveerd door blauw licht, zelfs bij lage intensiteiten, en dus, om ChrimsonR te combineren met Chronos in tweekleurige CRACM-experimenten, moeten zorgvuldige controles worden gebruikt om kruisactivering van ChrimsonR te voorkomen.

Protocol

Krijg goedkeuring van het lokale Comité voor institutionele dierenverzorging en -gebruik (IACUC) en houd zich aan de NIH-richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Alle procedures in dit protocol werden goedgekeurd door de Universiteit van Michigan IACUC en waren in overeenstemming met NIH richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. 1. Chirurgie Voorbereidingen Voer operaties uit in aseptische omstandigheden. Autoclave/steriliseren alle chirurg…

Representative Results

We staken VIP-IRES-Cre muizen (Viptm1 (cre)Zjh/J) en Ai14 Cre-reporter muizen (B6. Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) om F1-nakomelingen te genereren waarin VIP-neuronen het fluorescerende eiwit tdTomato uitdrukken. F1 nakomelingen van beide geslachten werden gebruikt, leeftijd postnatale dag (P) 21 tot P70. In totaal werden 22 dieren gebruikt in deze studie. Stereotaxic injectie van…

Discussion

We hebben ontdekt dat CRACM is een krachtige techniek voor het identificeren en karakteriseren van lange afstand synaptische ingangen aan neuronen in de muis IC. Naar aanleiding van het protocol dat hier is beschreven, bereikten we robuuste transfection van neuronen in de DCN en IC, evenals betrouwbare axonale handel van Chronos en ChrimsonR naar synaptische terminals in de IC. Daarnaast hebben we aangetoond dat deze techniek het mogelijk maakt om berichtenynaptische gebeurtenissen te meten en te analyseren, waaronder PS…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door een Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, projectnummer 401540516, aan DG) en National Institutes of Health grant R56 DC016880 (MTR).

Materials

AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH Addgene 59171-AAV1
AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH Addgene 59170-AAV1
Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) Jackson Laboratory stock #007914
Amber (590nm) LUXEON Rebel LED Luxeon Star LEDs SP-01-A8
Blue (470nm) LUXEON Rebel LED Luxeon Star LEDs SP-01-B4
Carproject (carprofen) Henry Schein Animal Health 59149
Drummond glas capillaries Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X
Drummond Nanoject 3 Drummond Scientific Company 3-300-207
Electrode beveler Sutter Instrument FG-BV10-D
Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures Ethicon local pharmacy
Fixed stage microscope any n/a
Gas anesthesia head holder David Kopf Instruments 933-B
General surgery tools Fine Science Tools N/A
Golden A5 pet clipper Oster 078005-010-003
Heating pad Custom build N/A
Hooded induction chamber w/ vacuum system Patterson Scientific 78917760
Hot bead sterilizer Steri 250 Inotech IS-250
Iodine solution 10% MedChoice local pharmacy
Isoflurane vaporizer Patterson Scientific 07-8703592
Lidocain topical jelly 2% Akorn local pharmacy
Micro motor drill 1050 Henry Schein Animal Health 7094351
Micro motor drill bits 0.5 mm Fine Science Tools 19007-05
Motorized Micromanipulator Sutter Instrument MP-285/R
Ophthalmic ointment Artificial Tears Akorn local pharmacy
P-1000 electrode puller Sutter Instrument P-1000
Patch clamp amplifier incl data acquisition software any n/a
Portable anethesia machine Patterson Scientific 07-8914724
Small animal steroetaxic frame David Kopf Instruments 930-B
Standard chemicals local vendors N/A
standard imaging solutions
Sterile towel drapes Dynarex 4410
Surgical marker Fine Science Tools 18000-30
Temperature controller Custom build N/A
Vibratome any n/a
VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) Jackson Laboratory stock #010908
Water bath any n/a

References

  1. Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).
  2. Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping. Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
  3. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
  4. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).
  5. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
  6. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11, 338-346 (2014).
  7. Flotte, T. R. Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).
  8. Aponte-Ubillus, J. J., et al. Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production. Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).
  9. Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13, 325-328 (2016).
  10. Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).
  11. Mager, T., et al. High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics. Nature Communications. 9, (2018).
  12. Oda, K., et al. Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson. Nature Communications. 9, (2018).
  13. Hooks, B. M. Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations. Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).
  14. Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. 遗传学. 200, 1029-1034 (2015).
  15. Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience. Neuron. 96, 572-603 (2017).
  16. Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation. Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).
  17. Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  18. Oliver, D. L. Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study. Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).
  19. Oliver, D. L. Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction. Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).
  20. Glendenning, K. K., Masterton, R. B. Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive. Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).
  21. Adams, J. C. Ascending projections to the inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).
  22. Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).
  23. Saldaña, E., Merchań, M. A. Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).
  24. Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
  25. Felix, R. A., Gourévitch, B., Portfors, C. V. Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders. Hearing Research. 362, 48-60 (2018).
  26. Winer, J. A., Schreiner, C., Winer, J. A., Schreiner, C., et al. . The inferior colliculus: with 168 illustrations. , (2005).
  27. Goyer, D., et al. A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice. eLife. 8, e43770 (2019).

Play Video

Cite This Article
Goyer, D., Roberts, M. T. Long-range Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping of Inferior Colliculus Neurons with Blue and Red-shifted Channelrhodopsins. J. Vis. Exp. (156), e60760, doi:10.3791/60760 (2020).

View Video