Summary

عدوى السالمونيلا المزمنة الناجمة عن التليف المعوي

Published: September 22, 2019
doi:

Summary

يصف هذا البروتوكول نموذج الماوس من التليف المعوي الذي يحركه السالمونيلا الذي يشبه السمات المرضية الرئيسية لمرض كرون بما في ذلك التهاب عبر الجدارية والتليف. يمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم العوامل المضيفة التي تغير النتائج الليفية باستخدام الفئران المتحولة التي تم الحفاظ عليها على خلفية وراثية C57Bl/6.

Abstract

تليف الأنسجة يتميز بالتراكم المرضي للمصفوفة خارج الخلية مثل الكولاجين هو نتيجة للالتهاب المستمر وإصلاح dysregulated. في مرض الأمعاء الالتهابي (IBD)، يؤدي التليف إلى تشكيلات تضيق متكررة لا يوجد علاج فعال لها سوى الاستئصال الجراحي. بسبب ظهورها في وقت متأخر، والعمليات التي تدفع التليف هو أقل دراسة وغير معروف إلى حد كبير. ولذلك، فإن المضاعفات الليفية تمثل تحديا كبيرا في IBD. في هذا البروتوكول، يتم وصف نموذج قوي في الجسم الحي من التليف المعوي حيث العقدية قبل العلاج من الفئران C57Bl/6 تليها اللقاحات عن طريق الفم مع الصف لقاح السالمونيلا Typhimurium ΔAroA متحولة يؤدي إلى الاستعمار المسبب المستمر و التليف من cecum. منهجيات إعداد S. يتم شرح قياس الأحمال المسببة للأمراض في السيكوم والطحال، وتقييم ترسب الكولاجين في الأنسجة المعوية. هذا النموذج المرض التجريبي مفيد لفحص العوامل المضيفة التي إما تعزيز أو تفاقم التليف المعوي الشبيه بالقرص المضغوط.

Introduction

التهاب القولون التقرحي (UC) ومرض كرون (CD) هما الشكلان الرئيسيان من IBD ويتميزان بالاضطرابات الالتهابية المزمنة والانتكاسية في الجهاز الهضمي 1،2. هذه الاضطرابات لها تأثير كبير على نوعية حياة المرضى. وتشمل أعراض IBD آلام البطن والإسهال والغثيان وفقدان الوزن والحمى والتعب3. وقد حددت الدراسات الحديثة العوامل الوراثية والبيئية التي تسهم في مسببات الأمراض؛ ويعتقد أن عوامل الخطر هذه تسهم في تعطيل الحاجز الظهاري مما يؤدي إلى نقل أو الإفراط في المستضدات الإنارة4. ونتيجة لذلك ، فإن هذا يبدأ استجابة التهابية شاذة للنباتات commensal بوساطة الخلايا المناعية المعوية4. قد تمتد ملامح المضاعفات المرتبطة بـ IBD إلى مواقع خارج الجهاز الهضمي التي تؤثر على مختلف الأجهزة بما في ذلك المفاصل والجلد والكبد1و2. وتشمل السمات المميزة للجامعة الوسطى التهاب حاد ومنتشر عادة المترجمة في القولون1. أمراض المرض يؤثر على الغشاء المخاطي وsubmucosa من الأمعاء مما أدى إلى تقرحات الغشاء المخاطي السطحي1. وعلى النقيض من ذلك، يمكن أن يؤثر القرص المضغوط على أي جزء من الجهاز الهضمي على الرغم من أن الأدلة على المرض توجد عادة في القولون واللفائفي القاصي2. وعلاوة على ذلك، فإن التهاب في القرص المضغوط هو transmural، مما يؤثر على جميع طبقات جدار الأمعاء2.

العديد من الجينات حساسية IBD التي تم تحديدها تشير إلى أن خلل تنظيم الحاجز الظهاري أو الحصانة هي العوامل الحاسمة في تطور المرض5. تم العثور على الطفرات في مجال القلة النيوكليوتيدات 2 (NOD2) التي أعربت عنها الخلايا الأحادية أن تكون مرتبطة بزيادة قابلية للإصابة بالقرص المضغوط; هذا يسلط الضوء على وجود صلة بين الكشف المناعي الفطري المتغير للمكونات البكتيرية والمرض6. وقد كشفت دراسات الارتباط على نطاق الجينوم (GWAS) أحدث مسارات إضافية يحتمل أن تشارك في مسببات الأمراض من IBD بما في ذلك الاختلافات الوراثية في: STAT1، NKX2-3، IL2RA، المسارات المعتمدة IL23R مرتبطة الحصانة التكيفية، MUC1، MUC19، وPTGER4 في صيانة حاجز الأمعاء، وATG16Lبوساطة autophagy9. في حين أن هذه الدراسات الوراثية القائمة على السكان قد عززت فهمنا للIBD, الأليلات قابلية وحدها من المرجح أن تكون غير كافية في بدء وإدامة الأمراض المزمنة3. وقد ارتبطت عوامل أخرى غير وراثية بما في ذلك التعديلات في تكوين ميكروبيوم الأمعاء والحد من التنوع مع التهاب الأمعاء. ومع ذلك، فمن غير الواضح ما إذا كان عسر الهضم الأمعاء يسبق أو هو نتيجة لعسر تنظيم الاستجابات المناعية3. على الرغم من أن مسببات IBD لا تزال غير واضحة، وقد تعزز فهمنا لمسببات المرض من قبل نماذج الماوس التجريبية من التهاب الأمعاء10،11. هذه النماذج بشكل فردي لا تمثل تماما تعقيد المرض البشري، ولكنها قيمة لتوضيح المسارات المرضية الفسيولوجية التي يمكن أن تكون ذات صلة IBD وللتحقق من الاستراتيجيات العلاجية المؤقتة10، 11. نماذج الماوس هذه تعتمد عادة على بدء الالتهاب عن طريق الحث الكيميائي أو العدوى، ونقل الخلايا المناعية، أو التلاعب الوراثي. وعلاوة على ذلك، كثيرا ما تنطوي هذه الاستراتيجيات على اضطرابات في السلامة الظهارية أو تعديل المناعة الفطرية أو التكيفية.

السالمونيلا المعوية هي مسببات الأمراض المعوية التي يمكن أن تصيب البشر والفئران. بعد الابتلاع، السالمونيلا يمكن استعمار الأمعاء عن طريق الغزو المباشر للظهارة، والخلايا M، أو مستضد تقديم الخلايا12. الفئران المصابة شفويا مع S. ينتج عن التيفيمويوم في استعمار المواقع النظامية في المقام الأول مثل الطحال والغدد الليمفاوية المساريقية مع وفرة منخفضة نسبيا في الجهاز الهضمي12. ومع ذلك ، فإن المعالجة المسبقة للفئران مع العقديات تعزز كفاءة استعمار السالمونيلا للأمعاء عن طريق تقليل الآثار الوقائية للميكروبيوتاالعادية 13. وتشمل السمات المرضية لهذا النموذج تعطيل أو تقرح الحاجز الظهاري، وتوظيف المحببات، وذمة شديدة13. بدلا من ذلك، العدوى مع لقاح الصف S. تيفيميوم ΔAroA متحولة يؤدي إلى الاستعمار المزمن من cecum والقولون الذي يستمر حتى اليوم 40 بعد العدوى14. الـ S. سلالة تيفيمواليوم ΔAroA لديه عيب في التركيب الحيوي للأحماض الأمينية العطرية. وهذا يجعل سلالة متحولة avirulent ويمكن استخدامها كلقاح فعال للغاية15. العدوى عن طريق الفم في الفئران يؤدي إلى استجابة التهابية Th1- و Th17-السيتوكين المرتبطة، وإعادة عرض الأنسجة واسعة النطاق، وترسب الكولاجين. ويرتبط علم أمراض الأنسجة مع مستويات مرتفعة من العامل الليفي الموالية مثل TGF-β1, CTGF, ومنتدى إدارة الإنترنت14. تندب الليفي عبر جدارية ذكرت في هذا النموذج تذكرنا تشكيلات التضيق غالبا ما لوحظ في IBD. الحث من التليف من قبل السالمونيلا يتطلب ضراوة ترميز من قبل جزر السالمونيلا المسببة للأمراض (SPI)-1 و 2 12. الأهم من ذلك، هذا S. نموذج العدوى Tymphimurium ΔAroA هو نظام مفيد لدراسة الاستجابات الليفية في الفئران متحولة الحفاظ على خلفية C57/Bl6. سلالة C57/Bl6 حساسة للغاية لS. عدوى التيفييومويوم SL1344 بسبب طفرة فقدان الوظيفة في الجينات ترميز بروتين الضامة الطبيعي المرتبط بالمقاومة (NRAMP)-116,17. لقد وجدنا أن IL-17A وRORα تعتمد على الخلايا الليمفاوية الفطرية هي المساهمين المهمين في مسببات الأمراض في هذا النموذج18.

ومن المضاعفات الرئيسية للقرص المضغوط هو الترسيب غير المنظم والمفرط للمصفوفة خارج الخلية (ECM) بما في ذلك الكولاجين2،19. على الرغم من أن الجهاز الهضمي لديه قدرة عالية نسبيا لتجديد, تندب الليفي يمكن أن تنشأ بسبب استجابات التئام الجروح التي لم تحل التي ترتبط مع التهاب مزمن وحاد20,21. في مؤتمر نزع السلاح، وهذا يؤدي إلى آثار ضارة على بنية الأنسجة مما يؤدي إلى ضعف كبير في الجهاز21،22. الطبيعة عبر جدارية للالتهاب لوحظ في مؤتمر نزع السلاح في نهاية المطاف تسبق سماكة جدار الأمعاء المرتبطة تضيق أعراض أو تشكيل تضيق21. حوالي ثلث مرضى القرص المضغوط تتطلب استئصال الأمعاء لهذه المضاعفات22. لا توجد علاجات فعالة مضادة للليفي في IBD بالنظر إلى أن استخدام مثبطات المناعة مثل أزاثيوبرين أو مضادات TNFα البيولوجيا ليس لها تأثير أو خفضت فقط بشكل متواضع متطلبات التدخلات الجراحية19،23 . في حين يعتقد أن التليف هو نتيجة للالتهاب المزمن، ويعتقد أن الخلايا من أصل mesenchymal مثل الخلايا الليفية وpericytes لتكون المصادر الخلوية الأولية من ECM في تندب الليفي21،24. S المزمنة. عدوى تيفيموريوم ΔAroA هو نموذج ماوس قوي من التليف المعوي الذي يمكن أن يقدم رؤى في مسببات الأمراض من الميزات الشبيهة بالقرص المضغوط.

Protocol

تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الحيوانات من قبل لجنة رعاية الحيوانات في جامعة كولومبيا البريطانية. 1. إعداد الثقافات السالمونيلا التيفيموريوم ΔAroA لاللقاحات عن طريق الفم من الفئران من مخزون الجلسرين المجمد من S. Typhimurium ΔAroA، وإعداد لوحة خط باستخدام أجار LB تح?…

Representative Results

علاج العقديات تليها العدوى عن طريق الفم مع S. التيفيموريوم ΔAroA يؤدي إلى التهاب معوي قوي والتليف وخاصة في cecum(الشكل 1). يمكن استرداد أعباء مسببات الأمراض النموذجية من 108 إلى 109 CFU لكل 1 غرام من cecum و 104 CFU لكل 1 غرام من الطحال من الحيوانات المصابة(ا…

Discussion

وقد تعزز فهمنا لمسببات الأمراض من IBD إلى حد كبير من قبل نماذج الماوس من التهاب الأمعاء. وعلى الرغم من أن هذه النماذج الفردية لا تُلخص جميع سمات المرض البشري المعقد والمتعدد العوامل، فقد كانت مفيدة في تحديد السمات الرئيسية لتطور المرض. لا تزال القيود الليفية المرتبطة بـ IBD حاجة سريرية كبيرة …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر إنغريد بارتا على خدمات علم الأنسجة.

Materials

2 ml round bottom safe lock tubes Eppendorf 22363344
Stainless steel beads Qiagen 69989
PBS Gibco 10010031
Large-Orifice Pipet Tips Fisher 2707134
2 mL megablock plates Sarstedt 82.1972.002
Gavage needles FST 18061-22
Streptomycin sulfate Sigma S9137
Mixer mill Retsch MM

References

  1. Danese, S., Fiocchi, C. Ulcerative colitis. New England Journal of Medicine. 365 (18), 1713-1725 (2011).
  2. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. The Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
  3. Knights, D., Lassen, K. G., Xavier, R. J. Advances in inflammatory bowel disease pathogenesis: linking host genetics and the microbiome. Gut. 62 (10), 1505-1510 (2013).
  4. Xavier, R. J., Podolsky, D. K. Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature. 448 (7152), 427-434 (2007).
  5. Cho, J. H. The genetics and immunopathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature Reviews Immunology. 8 (6), 458-466 (2008).
  6. Ogura, Y., et al. A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn’s disease. Nature. 411 (6837), 603-606 (2001).
  7. Jostins, L., et al. Host-microbe interactions have shaped the genetic architecture of inflammatory bowel disease. Nature. 491 (7422), 119-124 (2012).
  8. Rivas, M. A., et al. Deep resequencing of GWAS loci identifies independent rare variants associated with inflammatory bowel disease. Nature Genetics. 43 (11), 1066-1073 (2011).
  9. Rioux, J. D., et al. Genome-wide association study identifies new susceptibility loci for Crohn disease and implicates autophagy in disease pathogenesis. Nature Genetics. 39 (5), 596-604 (2007).
  10. Uhlig, H. H., Powrie, F. Mouse models of intestinal inflammation as tools to understand the pathogenesis of inflammatory bowel disease. European Journal of Immunology. 39 (8), 2021-2026 (2009).
  11. Nell, S., Suerbaum, S., Josenhans, C. The impact of the microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8 (8), 564-577 (2010).
  12. Grassl, G. A., Finlay, B. B. Pathogenesis of enteric Salmonella infections. Current Opinion in Gastroenterology. 24 (1), 22-26 (2008).
  13. Barthel, M., et al. Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host. Infection and Immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).
  14. Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K., Vallance, B. A., Finlay, B. B. Chronic Enteric Salmonella Infection in Mice Leads to Severe and Persistent Intestinal Fibrosis. Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).
  15. Hoiseth, S. K., Stocker, B. A. Aromatic-dependent Salmonella typhimurium are non-virulent and effective as live vaccines. Nature. 291 (5812), 238-239 (1981).
  16. Valdez, Y., Ferreira, R. B., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Salmonella virulence and host resistance. Current Topics in Microbiology and Immunology. 337, 93-127 (2009).
  17. Valdez, Y., et al. Nramp1 drives an accelerated inflammatory response during Salmonella-induced colitis in mice. Cellular Microbiology. 11 (2), 351-362 (2009).
  18. Lo, B. C., et al. The orphan nuclear receptor RORalpha and group 3 innate lymphoid cells drive fibrosis in a mouse model of Crohn’s disease. Science Immunology. 1 (3), eaaf8864 (2016).
  19. Burke, J. P., et al. Fibrogenesis in Crohn’s disease. American Journal of Gastroenterology. 102 (2), 439-448 (2007).
  20. Hogan, B. L., et al. Repair and regeneration of the respiratory system: complexity, plasticity, and mechanisms of lung stem cell function. Cell Stem Cell. 15 (2), 123-138 (2014).
  21. Fiocchi, C., Lund, P. K. Themes in fibrosis and gastrointestinal inflammation. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (5), G677-G683 (2011).
  22. Rieder, F., Fiocchi, C. Intestinal fibrosis in IBD—a dynamic, multifactorial process. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 6 (4), 228-235 (2009).
  23. Bouguen, G., Peyrin-Biroulet, L. Surgery for adult Crohn’s disease: what is the actual risk?. Gut. 60 (9), 1178-1181 (2011).
  24. Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of Pathology. 214 (2), 199-210 (2008).
  25. Junqueira, L. C., Bignolas, G., Brentani, R. R. Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections. Histochem J. 11 (4), 447-455 (1979).
  26. Lo, B. C., et al. IL-22 Preserves Gut Epithelial Integrity and Promotes Disease Remission during Chronic Salmonella Infection. Journal of Immunology. 202 (3), 956-965 (2019).
  27. Fichtner-Feigl, S., et al. Induction of IL-13 triggers TGF-beta1-dependent tissue fibrosis in chronic 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid colitis. Journal of Immunology. 178 (9), 5859-5870 (2007).
  28. Fichtner-Feigl, S., et al. IL-13 signaling via IL-13R alpha2 induces major downstream fibrogenic factors mediating fibrosis in chronic TNBS colitis. Gastroenterology. 135 (6), e2001-e2007 (2013).
  29. Johnson, L. A., et al. Intestinal fibrosis is reduced by early elimination of inflammation in a mouse model of IBD: impact of a "Top-Down" approach to intestinal fibrosis in mice. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (3), 460-471 (2012).
  30. Darfeuille-Michaud, A., et al. High prevalence of adherent-invasive Escherichia coli associated with ileal mucosa in Crohn’s disease. Gastroenterology. 127 (2), 412-421 (2004).
  31. Small, C. L., Reid-Yu, S. A., McPhee, J. B., Coombes, B. K. Persistent infection with Crohn’s disease-associated adherent-invasive Escherichia coli leads to chronic inflammation and intestinal fibrosis. Nature Communications. 4, 1957 (2013).
  32. Imai, J., et al. Flagellin-mediated activation of IL-33-ST2 signaling by a pathobiont promotes intestinal fibrosis. Mucosal Immunology. , (2019).

Play Video

Cite This Article
Lo, B. C., Shin, S. B., Messing, M., McNagny, K. M. Chronic Salmonella Infection Induced Intestinal Fibrosis. J. Vis. Exp. (151), e60068, doi:10.3791/60068 (2019).

View Video