Здесь мы представляем протокол механической диссоциации для быстрого изолировать макрофаги от кислого корневого ганглия для фенотипирования и функционального анализа.
Есть растущие интересы для изучения молекулярных и клеточных взаимодействий между иммунными клетками и сенсорными нейронами в корнях печени ганглиев после повреждения периферического нерва. Периферийные моноцитные клетки, в том числе макрофаги, как известно, реагируют на повреждение тканей с помощью фагоцитоза, антигена презентации, и цитокинов релиз. Новые данные причастны вклад дорсального корня ганглиев макрофагов к развитию нейропатической боли и аксонального ремонта в контексте травмы нерва. Быстро фенотипирования (или “быстрой изоляции”) ответ на торсальные корня ганглиев макрофагов в контексте травмы нерва желательно определить неизвестные нейроиммунные факторы. Здесь мы демонстрируем, как наша лаборатория быстро и эффективно изолирует макрофаги от корня в сонто, используя протокол механической диссоциации без ферментов. Образцы хранятся на льду во всем, чтобы ограничить клеточный стресс. Этот протокол гораздо меньше времени по сравнению со стандартным ферментативным протоколом и регулярно используется для нашего анализа сортировки с плавающей с плавающей сортировки с флуоресценцией.
Существует в настоящее время значительные доказательства того, что иммунные клетки способствуют невропатической боли после повреждения периферического нерва1,2. Периферических моноцитных клеток, в том числе зрелых макрофагов, как известно, реагировать на повреждения тканей и системной инфекции через фагоцитоз, антиген презентации, и цитокинов релиз. Параллельно нервной травмы индуцированной активации микроглии в спинномозговой рог, макрофаги в спинной корнегганглия (DRG) также значительно расширить после травмы нерва3,4. Примечательно, что есть растущие интересы, чтобы определить, если макрофаги способствуют развитию нейропатической боли после повреждения периферического нерва, взаимодействуя с сенсорными нейронами в DRG5,6,7, 8 , 9 До 9 , 10 Лет , 11. Кроме того, последние исследования также связаны с вкладом DRG макрофагов в аксональный ремонт после повреждения нерва12,13. Другое исследование также предполагает, что макрофаг субпопуляции (т.е., CD11bиLy6Cпривет и CD11b–Ly6Cнизкий /- клетки) может играть иную роль в механической гиперчувствительности14. Таким образом, быстро фенотипирования ответ DRG макрофагов в контексте травмы нерва может помочь нам определить нейроиммунные факторы, способствующие нейропатической боли.
Условно, протокол для изоляции макрофагов в DRG включает в себя несколько шагов, включая ферментативное пищеварение15,16. Этот метод часто занимает много времени и может быть дорогостоящим для крупномасштабных экспериментов. Хотя мягкое пищеварение с коллагеназой II типа (4 мг/мл) и диспация II типа (4,7 мг/мл) в течение 20 мин было рекомендовано ранее15, можно предположить, что клетки после воздействия этого фермента склонны к повреждению клеток или смерти клеток, что может привести к низкой Урожайность. Кроме того, разница в качестве ферментов от партии к партии может еще больше повлиять на эффективность этого процесса. Что еще более важно, макрофаги подвергаются фермент пищеварения может быть нежелательно стимулировали и, таким образом, может быть очень отличается от статуса in-vivo. Изменения потенциально могут осложнить результаты функционального исследования.
Здесь мы описываем протокол без ферментов для быстрого изоляции макрофагов DRG при 4 градусах Цельсия с помощью механической диссоциации. Образцы хранятся на льду, чтобы ограничить клеточный стресс. В результате, наш подход обеспечивает преимущество для поддержания последовательности изоляции, и изолированные клетки, по-видимому, здоровее и менее стимулировали. Мы также представляем доказательства для проверки качества изолированных клеток с помощью анализа сортировки клеток fluorescence (FACS).
Здесь мы вводим новый метод эффективного обогащения изолированных макрофагов от мыши DRG. Обычный подход к изоляции ИММУННых клеток DRG требует ферментативного пищеварения15,18, который в настоящее время заменяется механической гомогенизации в нашем прото?…
The authors have nothing to disclose.
Исследование было поддержано: Фонд омицации и исследований (XY); отделение анестезии и периоперационной помощи UCSF (XY); и 1R01NS100801-01 (ГЗ). Это исследование было частично поддержано Лабораторией анализа клеток ЛАБОРАТОРИей анализа клеток через грант от NIH (P30CA082103).
AP20187 | Clontech | 635058 | |
a-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
Avertin | Sigma | T48402 | |
Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |