Snelle isolatie van dorsale wortel ganglion macrofagen
Summary
Hier presenteren we een mechanisch dissociatie protocol om macrofagen snel te isoleren van de dorsale wortel ganglion voor fenotypering en functionele analyse.
Abstract
Er zijn groeiende belangen om te bestuderen van de moleculaire en cellulaire interacties tussen immune cellen en sensorische neuronen in de rugwortel ganglia na perifere zenuw letsel. Perifere monocytische cellen, waaronder macrofagen, zijn bekend om te reageren op een weefsel letsel door middel van fagocytose, antigeen presentatie, en cytokine vrijlating. Opkomende bewijsmateriaal impliceerde de bijdrage van rugwortel ganglia macrofagen aan neuropathische pijn ontwikkeling en axonale reparatie in de context van zenuw letsel. Snel fenotypen (of “snelle isolatie van”) de reactie van rugwortel ganglia macrofagen in de context van zenuw letsel is gewenst om de onbekende neuroimmuunfactoren te identificeren. Hier laten we zien hoe ons lab snel en effectief macrofagen isoleert van de dorsale wortel ganglia met behulp van een enzymvrij mechanisch dissociatie protocol. De monsters worden op het ijs gehouden om cellulaire stress te beperken. Dit protocol is veel minder tijdrovend in vergelijking met het standaard enzymatische protocol en is routinematig gebruikt voor onze fluorescentie-geactiveerde Celsorterings analyse.
Introduction
Er is nu aanzienlijk bewijs dat immuuncellen bijdragen aan de neuropathische pijn na beschadiging van de perifere zenuw1,2. Perifere monocytische cellen, waaronder volwassen macrofagen, zijn bekend om te reageren op weefsel letsel en systemische infectie door middel van fagocytose, antigeen presentatie, en cytokine vrijlating. Parallel aan de zenuw letsel-geïnduceerde Microglia activering in de ruggenmerg rughoorn, macrofagen in de dorsale wortel ganglia (DRG) ook uit te breiden aanzienlijk na zenuw letsel3,4. Met name, er zijn groeiende belangen om te bepalen als macrofagen bijdragen tot neuropathische pijn ontwikkeling na perifere zenuw letsel door interactie met sensorische neuronen in de DRG5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11. Bovendien betrekken recente studies ook de bijdrage van DRG-macrofagen in de axonale herstelling na zenuwbeschadiging12,13. Een andere studie suggereert verder dat macrofaag subpopulaties (d.w.z. CD11b+Ly6CHi en CD11b+Ly6Clage/- cellen) een andere rol kunnen spelen in de mechanische overgevoeligheid14. Daarom kan het snel fenotypen van de reactie van DRG-macrofagen in de context van zenuw letsel ons helpen neuroimmuunfactoren te identificeren die bijdragen aan neuropathische pijn.
Conventioneel, het protocol voor het isoleren van macrofagen in de DRG omvat meerdere stappen, met inbegrip van enzymatische spijsvertering15,16. De techniek is vaak tijdrovend en kan kostbaar zijn voor grootschalige experimenten. Hoewel milde spijsvertering met collagenase type II (4 mg/mL) en dispase type II (4,7 mg/mL) gedurende 20 minuten werd aanbevolen eerder15, is het denkbaar dat cellen na de blootstelling aan dit enzym gevoelig zijn voor celbeschadiging of celdood, wat kan leiden tot lage Opbrengst. Bovendien kan het verschil in de kwaliteit van enzymen van batch tot batch de efficiëntie van dit proces verder beïnvloeden. Belangrijker is dat macrofagen die worden blootgesteld aan de spijsvertering van het enzym ongewenst gestimuleerd worden en dus zeer verschillend kunnen zijn van de in vivo status. De veranderingen kunnen de uitkomst van de functionele studie compliceren.
Hier beschrijven we een enzymvrij protocol om DRG-macrofagen snel te isoleren bij 4 °C met behulp van mechanische dissociatie. De monsters worden op ijs gehouden om cellulaire stress te beperken. Als gevolg daarvan biedt onze aanpak een voordeel om de consistentie van de isolatie te behouden, en de geïsoleerde cellen zijn vermoedelijk gezonder en minder gestimuleerd. We presenteren verder het bewijsmateriaal om de kwaliteit van de geïsoleerde cellen te valideren met de analyse van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier introduceren we een nieuwe methode om geïsoleerde macrofagen effectief te verrijken van muis DRG. De conventionele aanpak voor het isoleren van DRG-immuuncellen vereist enzymatische spijsvertering15,18, die nu wordt vervangen door mechanische homogenisatie in ons protocol om ongewenste celbeschadiging te beperken en de opbrengst te verhogen. Daarom is het nieuwe protocol veel minder tijdrovend. Wat nog belangrijker is, de enzym vertering kan de macrofagen s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De studie werd gesteund door: Stichting voor anesthesie onderwijs en onderzoek (XY); de afdeling van de UCSF anesthesie en perioperatieve zorg (XY); en 1R01NS100801-01 (GZ). Deze studie werd deels ondersteund door het HDFCCC-laboratorium voor de gedeelde bronnen faciliteit voor Celanalyse door middel van een subsidie van de NIH (P30CA082103).
Materials
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| a-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
References
- Ji, R. R., Chamessian, A., Zhang, Y. Q. Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation. Science. 354 (6312), 572-577 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neurosciences. 19 (3), 138-152 (2018).
- Hu, P., McLachlan, E. M. Distinct functional types of macrophage in dorsal root ganglia and spinal nerves proximal to sciatic and spinal nerve transections in the rat. Experimental Neurology. 184 (2), 590-605 (2003).
- Simeoli, R., Montague, K., Jones, H. R., et al. Exosomal cargo including microRNA regulates sensory neuron to macrophage communication after nerve trauma. Nature Communication. 8 (1), 1778 (2017).
- Cobos, E. J., Nickerson, C. A., Gao, F., et al. Mechanistic differences in neuropathic pain modalities revealed by correlating behavior with global expression profiling. Cell Reports. 22 (5), 1301-1312 (2018).
- Zhang, H., Li, Y., de Carvalho-Barbosa, M., et al. Dorsal Root Ganglion Infiltration by Macrophages Contributes to Paclitaxel Chemotherapy-Induced Peripheral Neuropathy. The Journal of Pain. 17 (7), 775-786 (2016).
- Liu, T., van Rooijen, N., Tracey, D. J. Depletion of macrophages reduces axonal degeneration and hyperalgesia following nerve injury. Pain. 86 (1-2), 25-32 (2000).
- Peng, J., Gu, N., Zhou, L., et al. Microglia and monocytes synergistically promote the transition from acute to chronic pain after nerve injury. Nature Communication. 7, 12029 (2016).
- Barclay, J., Clark, A. K., Ganju, P., et al. Role of the cysteine protease cathepsin S in neuropathic hyperalgesia. Pain. 130 (3), 225-234 (2007).
- Lim, H., Lee, H., Noh, K., Lee, S. J. IKK/NF-kappaB-dependent satellite glia activation induces spinal cord microglia activation and neuropathic pain after nerve injury. Pain. 158 (9), 1666-1677 (2017).
- Rutkowski, M. D., Pahl, J. L., Sweitzer, S., van Rooijen, N., DeLeo, J. A. Limited role of macrophages in generation of nerve injury-induced mechanical allodynia. Physiology and Behavior. (3-4), 225-235 (2000).
- Kwon, M. J., Shin, H. Y., Cui, Y., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. Journal of Neuroscience. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Zigmond, R. E., Echevarria, F. D. Macrophage biology in the peripheral nervous system after injury. Progress in Neurobiology. 173, 102-121 (2019).
- Ghasemlou, N., Chiu, I. M., Julien, J. P., Woolf, C. J. CD11b+Ly6G- myeloid cells mediate mechanical inflammatory pain hypersensitivity. Proceedings of the National Academy of Science USA. 112 (49), E6808-E6817 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nature Protocols. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal Root Ganglia Isolation and Primary Culture to Study Neurotransmitter Release. Journal of Visualized Experiment. (140), (2018).
- Burnett, S. H., Kershen, E. J., Zhang, J., et al. Conditional macrophage ablation in transgenic mice expressing a Fas-based suicide gene. J Leukoc Biol. 75 (4), 612-623 (2004).
- Lopes, D. M., Malek, N., Edye, M., et al. Sex differences in peripheral not central immune responses to pain-inducing injury. Science Reports. 7 (1), 16460 (2017).
- Kim, Y. S., Anderson, M., Park, K., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Vicuna, L., Strochlic, D. E., Latremoliere, A., et al. The serine protease inhibitor SerpinA3N attenuates neuropathic pain by inhibiting T cell-derived leukocyte elastase. Nature Medicine. 21 (5), 518-523 (2015).
