Schnelle Isolierung von Dorsalwurzel Ganglion Makrophagen
Summary
Hier stellen wir ein mechanisches Dissoziationsprotokoll vor, um Makrophagen aus dem dorsalen Wurzelganglien für Phänotypisierung und funktionelle Analyse schnell zu isolieren.
Abstract
Es gibt wachsendes Interesse, die molekularen und zellulären Wechselwirkungen zwischen Immunzellen und sensorischen Neuronen in den dorsalen Wurzelganglien nach peripheren Nervenverletzungen zu untersuchen. Periphere monozytäre Zellen, einschließlich Makrophagen, sind dafür bekannt, auf eine Gewebeverletzung durch Phagozytose, Antigen-Präsentation und Zytokinfreisetzung zu reagieren. Neue Beweise haben den Beitrag von dorsalen Wurzelganglien Makrophagen zur neuropathische Schmerzentwicklung und axonale Reparatur im Zusammenhang mit Nervenverletzungen impliziert. Schnell phänotypisieren (oder “schnelle Isolierung von”) die Reaktion von dorsalen Wurzelganglien Makrophagen im Zusammenhang mit Nervenverletzungen ist gewünscht, um die unbekannten Neuroimmunfaktoren zu identifizieren. Hier zeigen wir, wie unser Labor Makrophagen aus den dorsalen Wurzelganglien mithilfe eines enzymfreien mechanischen Dissoziationsprotokolls schnell und effektiv isoliert. Die Proben werden durchweg auf Eis gehalten, um den zellulären Stress zu begrenzen. Dieses Protokoll ist im Vergleich zum standardenzymatischen Protokoll weit weniger zeitaufwändig und wurde routinemäßig für unsere fluorescence-aktivierte Zellsortierungsanalyse verwendet.
Introduction
Es gibt inzwischen erhebliche Hinweise darauf, dass Immunzellen zu den neuropathischen Schmerzen nach der peripheren Nervenverletzung1,2beitragen. Periphere monozytäre Zellen, einschließlich reifer Makrophagen, sind dafür bekannt, auf Gewebeverletzungen und systemische Infektionen durch Phagozytose, Antigen-Präsentation und Zytokinfreisetzung zu reagieren. Parallel zur nervenverletzungsinduzierten Mikroglia-Aktivierung im Spinaldorsalhorn dehnen sich Makrophagen in den Dorsalwurzelganglien (DRG) auch nach einer Nervenverletzung deutlich aus3,4. Insbesondere gibt es wachsendes Interesse zu bestimmen, ob Makrophagen zur neuropathisigen Schmerzentwicklung nach peripheren Nervenverletzungen beitragen, indem sie mit sensorischen Neuronen in der DRG5,6,7 , 8 , 9 , 10 , 11. Darüber hinaus implizieren neuere Studien auch den Beitrag von DRG-Makrophagen bei der axonalen Reparatur nach Nervenverletzungen12,13. Eine weitere Studie legt ferner nahe, dass Makrophagensubpopulationen (d. h. CD11b+Ly6Chi und CD11b+Ly6CLow/- Zellen) eine andere Rolle bei der mechanischen Überempfindlichkeit14spielen können. Daher kann eine schnelle Phänotypisierung der Reaktion von DRG-Makrophagen im Zusammenhang mit Einer Nervenschädigung uns helfen, Neuroimmunfaktoren zu identifizieren, die zu neuropathische Schmerzen beitragen.
Üblicherweise umfasst das Protokoll zur Isolierung von Makrophagen in der DRG mehrere Schritte, einschließlich der enzymatischen Verdauung15,16. Die Technik ist oft zeitaufwändig und kann für groß angelegte Experimente teuer werden. Obwohl eine milde Verdauung mit Kollagenase Typ II (4 mg/ml) und Dispase Typ II (4,7 mg/ml) für 20 min zuvor15empfohlen wurde, ist es denkbar, dass Zellen nach der Exposition gegenüber diesem Enzym anfällig für Zellschäden oder Zelltod sind, was zu aufgeben. Darüber hinaus kann der Unterschied in der Qualität der Enzyme von Charge zu Charge die Effizienz dieses Prozesses weiter beeinflussen. Noch wichtiger ist, dass Makrophagen, die der Enzymverdauung ausgesetzt sind, unerwünscht stimuliert werden und sich somit sehr vom In-vivo-Status unterscheiden können. Die Änderungen können das Ergebnis der funktionellen Studie möglicherweise erschweren.
Hier beschreiben wir ein enzymfreies Protokoll zur schnellen Isolierung von DRG-Makrophagen bei 4 °C mittels mechanischer Dissoziation. Die Proben werden auf Eis gehalten, um zellulären Stress zu begrenzen. Infolgedessen bietet unser Ansatz einen Vorteil, um die Konsistenz der Isolierung aufrechtzuerhalten, und die isolierten Zellen sind vermutlich gesünder und weniger stimuliert. Wir stellen außerdem den Nachweis vor, die Qualität der isolierten Zellen mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) zu validieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir eine neue Methode vor, um isolierte Makrophagen aus Maus-DRG effektiv anzureichern. Der konventionelle Ansatz, DRG-Immunzellen zu isolieren, erfordert eine enzymatische Verdauung15,18, die nun durch mechanische Homogenisierung in unserem Protokoll ersetzt wird, um unerwünschte Zellschäden zu begrenzen und die Ausbeute zu erhöhen. Daher ist das neue Protokoll weit weniger zeitaufwändig. Noch wichtiger ist, dass die Enzymverdauung die Makrophag…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Studie wurde unterstützt von: Foundation for Anesthesia Education and Research (XY); die UCSF-Abteilung für Anästhesie und Perioperative Versorgung (XY); und 1R01NS100801-01(GZ). Diese Studie wurde teilweise von der HDFCCC Laboratory for Cell Analysis Shared Resources Facility durch ein Stipendium des NIH (P30CA082103) unterstützt.
Materials
| AP20187 | Clontech | 635058 | |
| a-mouse CX3CR1-APC antibody | Biolegend | 149007 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Cell strainer (70 mm nylon) | Falcon | 352350 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dounce tissue homogenizer | Wheaton | 357538 (1ml) | |
| FACS tubes (5ml) | Falcon | 352052 | |
| Friedman-Pearson Rongeur | FST | 16121-14 | |
| HBSS (10x, Ca++/Mg++-free) | Gibco | 14185-052 | |
| Noyes Spring Scissor | FST | 15012-12 | |
| Percoll | Sigma | P4937-500ml | |
| Propidium iodide | Sigma | P4864-10ml |
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