Инъекционные яйца Gryllus bimaculatus
Summary
Здесь мы представляем протокол для введения крикет яйца, метод, который служит в качестве основополагающего метода во многих экспериментах в крикет, в том числе, но не ограничиваемся, РНК вмешательства и геномных манипуляций.
Abstract
Изменение функции генов в развивающемся организме занимает центральное место в различных видах экспериментов. В то время как чрезвычайно мощные генетические инструменты были разработаны в традиционных модельных системах, трудно манипулировать генами или РНК-мессенджером (мРНК) в большинстве других организмов. В то же время эволюционные и сравнительные подходы опираются на изучение функции генов у многих различных видов, что требует разработки и адаптации методов манипулирования экспрессией за пределами в настоящее время генетически высоченных Видов. Этот протокол описывает метод инъекций реагентов в яйца крикета, чтобы оценить влияние данной манипуляции на эмбриональное или личиночное развитие. Описаны инструкции по сбору и инъекциям яиц с помощью саженотых игл. Этот относительно простой метод является гибким и потенциально адаптируется к другим насекомым. Можно собрать и впрыснуть десятки яиц в одном эксперименте, а показатели выживаемости для инъекций только буфера улучшить с практикой и может быть выше, чем 80%. Этот метод будет поддерживать несколько типов экспериментальных подходов, включая инъекции фармакологических агентов, in vitro capped mRNA для выражения генов, представляющих интерес, двухцепочечной РНК (dsRNA) для достижения РНК-интерференции, использование кластерных регулярно межпространственные короткие палиндромные повторы (CRISPR) в сотрудничестве с реагентами, связанными с CRISPR, белка 9 (Cas9) для геномной модификации, и транспозируемыми элементами для генерации переходных или стабильных трансгенных линий.
Introduction
Способность изменять геном или влиять на экспрессию генов в организмах является основой для разработки многих типов экспериментов, тестируя функциональную причинность. Также крайне важно для сравнительной и эволюционно-соответствующей работы, чтобы методы геномной и негеномической модификации были доступны в организмах за пределами традиционных генетических лабораторных систем моделей животных (например, Mus musculus, Danio Рерио, Drosophila melanogaster, и Caenorhabditis elegans). Будь то желание понять разнообразие организма1 или свое соответствие принципу Крога, что для каждого биологического вопроса есть организм, наиболее подходящий для его решения 2,3, способность изменять геномы или влияние экспрессии генов имеет важное значение для современных экспериментальных конструкций.
Крикет Gryllus bimaculatus является новой модельной системой. Используется в течение последнего века в нейроэтиологии экспериментов4, за последние два десятилетия стали свидетелями повышенного экспериментального интереса к крикету, особенно сосредоточены на эволюции и развитии этого организма5. Сверчок является геммиметаболовым насекомым, которое ветвит базально хорошо изученных голометаболовых насекомых, таких как D. melanogaster и Tribolium castaneum6. Из-за его полезное положение на эволюционном дереве, ученые заинтересованы в задавать современные, сложные экспериментальные вопросы в этом насекомом, что привело к растущему интересу к адаптации молекулярных инструментов для использования в G. bimaculatus.
Инъекции молекулярных реагентов в яйца крикета могут быть использованы для экспериментов по геномной модификации, а также для негеномических манипуляций с экспрессией генов в эмбрионах. Например, трансгенные G. bimaculatus, несущие вставки eGFP, были созданы с использованием транспозасии piggyBac7,8. Следователи успешно создали нокаут G. bimaculatus с использованием цинк-пальца нуклеазы (ЗФН) и транскрипции активатор-как (TAL) эффектор nucleases (TALENs) ввести двухцепочечные перерывы в конкретных геномных регионах9. Несмотря на то, что ЗФН и TALENs позволяют ориентироваться на животных за пределами систем «большой четверки», эти реагенты быстро превзошли систему CRISPR/Cas9, которая проще в использовании, эффективнее и очень гибкая10. CRISPR был использован в G. bimaculatus для производства нокаут11, а также стук в линии12,13 В дополнение к геномной модификации, dsRNA может быть введен в яйца, чтобы сбить выражение мРНК в развивающихся эмбрионов, что позволяет следователям понять роль конкретных стенограмм на протяжении всего развития14,15. Некоторые ограниченные подробности о том, как вводить яйца крикет были опубликованы ранее12.
Здесь мы описываем подробный протокол для введения ранних яиц G. bimaculatus. Этот протокол эффективен и легко адаптируется к различным лабораторным настройкам, инъекционным материалам и, возможно, к другим насекомым. В то время как дополнительные детали для проектирования и реализации геномных модификаций и нокдаун экспериментов были опубликованы в другом месте12,13, эти подходы в конечном итоге будет опираться на протокол инъекций подробно описано здесь.
Protocol
Representative Results
Discussion
Двумя основными проблемами с этой техникой являются связанные с этим вопросы оптимального размера иглы и живучести. Хотя меньшие иглы улучшить живучесть, иглы с более узкими люминесцентными имеют большую степень капиллярных сил на работе, что делает его более вероятным, что желток буд…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования, о которых сообщалось в рамках этого проекта, были поддержаны премией институционального развития (IDeA) от Национального института общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения под грантом P20GM10342 до HH3, а также номером премии NSF IOS-1257217 Цгэ.
Materials
| Fluorescent dissecting microscope | Leica | M165 FC | Stereomicroscope with fluorescence | |
| External light source for fluorescence | Leica | EL 6000 | ||
| Microinjector | Narishige | IM-300 | -Accessories may include Injection Needles Holder, Input Hose (with a hose connector), AC Power Cord, Foot Switch, Silicone Rubber Gasket- | |
| mCherry filter cube | Leica | M205FA/M165FC | Filter cube for mCherry or similar red dye will work | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments, Inc. | M3301R | Used with Magnetic Stand (Narishige, Type GJ-8) | |
| Magnetic stand | Narishige | MMO-202ND | ||
| Pipette Holder (Needle holder) | Narishige | HD-21 | ||
| Tubing to connect air source to microinjector | ||||
| Egg well stamp | 3D printed | custom | 3D printed on a Lulzbot Taz 5 using Poly Lactic Acid thermoplastic | |
| Microwave | various | |||
| Incubator or temperature controlled room | various | Temperatures of 23.5-26°C are needed. | ||
| cricket food | various | cat food or fish flakes are appropriate food. | ||
| cricket wter | vairous | Water can be held in vials and presented to crickets through cotton balls | ||
| cricket shelter | arious | Shelter materials can include crumpled paper towels or egg cartons | ||
| Glass capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | Item no. 1B100F-4 | Kwik-Fil™ Borosilicate Glass Capillaries, 100mm length, 0.58 mm ID, 1.0 mm OD, with filament | |
| Micropipette puller | Flaming/Brown | Model P-97 | Distributed by Sutter Instrument Co. | |
| Beveller/Micro grinder | Narishige | Model EG-45/EG-400 | EG-400 includes a microscope head | |
| Petri dishes | CellTreat | Product code 229693 | 90mm diameter | |
| Play Sand | Sandtastik Products Ltd. | B003U6QLVS | White play sand | |
| Agarose | American Bioanalytical | AB000972 | Agarose GPG/LE ultrapure | |
| Egg Strainer: Extra Fine Twill Mesh Stainless Steel Conical Strainers | US Kitchen Supply | Model SS-C123 | Pore size should be between 0.5 – 1.0 mm | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco by Life Technologies | Ref 15070-063 | Pen Strep | |
| Plastic tweezers | Sipel Electronic SA | P3C-STD | Black Static Dissipative, 118mm | |
| syringe filters, 25mm diameter, 0.45 µm | Nalgene | 725-2545 | Use with 1 ml syringe | |
| 1 mL syringe, with Tuberculin Slip Tip | Becton Dickinson | 309602 | Use with syring filter to filter Injection Buffer , Luer-Lok tip syringes would also work | |
| Air tank (optional) | Midwest Products | Air Works® | Portable air tank | |
| Rhodamine dye | Thermofisher | D-1817 | dextran, tetramethylrhodamine 10,000MW, | |
| 20 mL loading tips | Eppendorf | Order no. 5242 956.003 | epT.I.P.S. 20uL Microloader | |
| Compound microscope | Zeiss | Axioskope 2 plus | ||
| 20X objective | Ziess | Plan-Apochromat 20x/0.75 M27 | ||
| camera | Leica | DMC 5400 | ||
| Leica Application Suite software | Leica | LAS | Version 4.6.2 used here | |
References
- Abzhanov, A., et al. Are we there yet? Tracking the development of new model systems. Trends in Genetics. 24 (7), 353-360 (2008).
- Krebs, H. A. The August Krogh principle: “For many problems there is an animal on which it can be most conveniently studied. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 194 (1), 221-226 (1975).
- Krogh, A. The Progress of Physiology. American Journal of Physiology. 90 (2), 243-251 (1929).
- Huber, F., Moore, T. E., Loher, W. . Cricket neurobiology and behavior. , (1989).
- Horch, H. W., Mito, T., Popadic, A., Ohuchi, H., Noji, S. . The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , (2017).
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346 (6210), 763-767 (2014).
- Nakamura, T., et al. Imaging of transgenic cricket embryos reveals cell movements consistent with a syncytial patterning mechanism. Current Biology. 20 (18), 1641-1647 (2010).
- Shinmyo, Y., et al. piggyBac-mediated somatic transformation of the two-spotted cricket, Gryllus bimaculatus. Development, growth & differentiation. 46 (4), 343-349 (2004).
- Watanabe, T., et al. Non-transgenic genome modifications in a hemimetabolous insect using zinc-finger and TAL effector nucleases. Nature communications. 3, 1017 (2012).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
- Awata, H., Watanabe, T., Hamanaka, Y., Mito, T., Noji, S., Mizunami, M. Knockout crickets for the study of learning and memory: Dopamine receptor Dop1 mediates aversive but not appetitive reinforcement in crickets. Scientific Reports. 5, 15885 (2015).
- Horch, H. W., Liu, J. J., Mito, T., Popadic, A., Watanabe, T. Protocols in the Cricket. The Cricket as a Model Organism: Development, Regeneration, and Behavior. , 327-370 (2017).
- Watanabe, T., Noji, S., Mito, T. Genome Editing in the Cricket, Gryllus bimaculatus. Genome Editing in Animals. , 219-233 (2017).
- Kainz, F., Ewen-Campen, B., Akam, M., Extavour, C. G. Notch/Delta signalling is not required for segment generation in the basally branching insect Gryllus bimaculatus. Development. 138 (22), 5015-5026 (2011).
- Miyawaki, K., et al. Involvement of Wingless/Armadillo signaling in the posterior sequential segmentation in the cricket, Gryllus bimaculatus (Orthoptera), as revealed by RNAi analysis. Mechanisms of Development. 121 (2), 119-130 (2004).
- Donoughe, S., Kim, C., Extavour, C. G. High-throughput live-imaging of embryos in microwell arrays using a modular specimen mounting system. Biology Open. 7 (7), bio031260 (2018).
- Donoughe, S., Nakamura, T., Ewen-Campen, B., Green, D. A., Henderson, L., Extavour, C. G. BMP signaling is required for the generation of primordial germ cells in an insect. Proceeding of the National Academy of Science USA. 111 (11), 4133-4138 (2014).
- Larson, E., Andres, J., Harrison, R. Influence of the male ejaculate on post-mating prezygotic barriers in field crickets. PLOS ONE. 7 (10), e46202 (2012).
- Donoughe, S., Extavour, C. G. Embryonic development of the cricket Gryllus bimaculatus. 发育生物学. , (2016).
- Matsuoka, Y., et al. Short germ insects utilize both the ancestral and derived mode of Polycomb group-mediated epigenetic silencing of Hox genes. Biology Open. 4 (6), 702-709 (2015).
- Rosenberg, M., Lynch, J., Desplan, C. Heads and tails: Evolution of antero-posterior patterning in insects. Biochimica et biophysica acta. 1789 (4), 333-342 (2009).
- Bacon, J., Strausfeld, N. Nonrandom resolution of neuron arrangements. Neuroanatomical Techniques: Insect Nervous System. , 357-372 (1980).
