Mycobacterium tüberküloz kompleksinin incelenmesi Için bir enfeksiyon modeli olarak ınvertebrate Galleria mellonella kullanımı
Summary
Galleria mellonella son zamanlarda Mycobacterium tüberküloz kompleksi için reproducible, ucuz ve etik olarak kabul edilebilir bir enfeksiyon modeli olarak kurulmuştur. Burada, Bioluminesans Mycobacterium bovis BCG Lux ile G. mellonella ‘nın başarılı enfeksiyonunu kurmak için alınan adımları tarif ediyoruz ve gösteriyoruz .
Abstract
Tüberküloz, bulaşıcı hastalık ölümlerinin önde gelen küresel nedenidir ve dünyanın nüfusu yaklaşık dörtte biri Mycobacterium tüberkülozile enfekte olduğuna inanılmaktadır. Onlarca yıl süren araştırmaya rağmen, M. tüberkülozunun patojenik bir organizma olarak başarısının arkasındaki mekanizmalar incelenmeye devam ediyor ve daha güvenli, daha etkili antimikobakteriyel ilaçların geliştirilmesi, yükselmenin üstesinden gelmek için acilen gerekli ilaç geçirmez tüberküloz yayılması. Ancak, tüberküloz araştırmalarının ilerlemesi pahalı, zaman alıcı ve etik açıdan zorlu olan geleneksel memeliyen enfeksiyon modelleri ile darboğazlıdır. Daha önce M. tüberküloz kompleksi üyeleri için bir roman, tekrarlanabilir, düşük maliyetli, yüksek verim ve etik olarak kabul edilebilir enfeksiyon modeli olarak böcek Galleria mellonella (büyük balmumu güvesi) larvaları kurduk. Burada Bioluminesans Mycobacterium bovis BCG Lux ile G. mellonella ‘nın bakım, hazırlama ve enfeksiyonunu tarif ediyoruz . Bu enfeksiyon modelini kullanarak, Mikobakteriyel doz bağımlı virülans görülebilir, ve biyoluminesans ölçümleri kullanarak in vivo Mikobakteriyel yükü hızlı bir okuma kolayca ulaşılabilir ve yeniden oluşturulabilir. Transcriptomik analiz için tam açıklamalı genom eksikliği gibi sınırlamalar mevcut olsa da, genetik olarak benzer böceklere karşı ontolojik analiz yapılabilir. Tüberküloz için düşük maliyetli, hızlı ve etik olarak kabul edilebilir bir model olarak, G. mellonella ilaç etkinliğini ve toksisitesi belirlemek için bir ön ekran olarak kullanılabilir ve konvansiyonel memelilerin kullanımından önce karşılaştırmalı Mikobakteriyel virülans belirlemek için Model. G. mellonella-mycobakteriler modelinin kullanımı, tüberküloz araştırmalarında Şu anda kullanılan hayvanların önemli sayıda azalmasına yol açacaktır.
Introduction
Tüberküloz (TB) yıl başına 9.000.000 yeni vaka ve 1.500.000 ölüm1ile küresel kamu sağlığı için önemli bir tehdittir. Buna ek olarak, dünya nüfusunun dörtte birinin hastalığın etken maddesi, Mycobacterium tüberküloz (MTB) ile enfekte olduğu tahmin edilmektedir. Virüslü nüfus arasında, 5 − 10% ömrü boyunca aktif TB hastalığı gelişecektir. Ayrıca, çok ilaç dirençli (MDR) ve kapsamlı-ilaç (XDR) dirençli MTB ortaya çıkması ve yayılması, 123 ülkeleri en az BIR XDR vaka1raporlama ile hastalık kontrolü için ciddi bir tehdit oluşturmaktadır. TB tedavisi, en az dört Anti-Mikobakteriyel ilaçların bir kokteyli gerektirir, hangi izoazid ve rifampisin altı ay minimum süre için reçete edilir; tedavi genellikle karmaşık yan etkileri ve toksisite ile ilişkilidir. TB karşı tek lisanslı aşı koruma, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), değişken2. Tüberküloz patogenezinin tamamlanmamış bir anlayışı, yeni terapötik ve aşılama stratejilerinin gelişmesini önemli ölçüde engelliyor.
Onlarca yıl boyunca hayvan enfeksiyonu modelleri tüberküloz araştırmalarında enfeksiyona temel patogenezi ve ev sahibi tepkisini anlamaları ve yeni anti-Mikobakteriyel ajanlar, immüno-terapi ve aşı adaylarının3‘ ü değerlendirmek için hayati önem taşıyor. 4. ancak, TB enfeksiyonunun patogenezi ve ilerlemesi karmaşıktır ve hastalığın tam spektrumunu ve önemli özelliklerini taklit eden tek bir hayvan modeli olmadığı için, tüberkülozdaki hayvan enfeksiyonu modellerini kullanarak araştırma oldukça zordur5 ,6. Ayrıca, hayvan deneyleri pahalı, zaman alıcı taahhüt ve tam etik gerekçe gerektirir. Yine de, TB hayvan enfeksiyonu modelleri (örneğin, Macaques), kobay, tavşan, sığır, domuz, fareler ve zebrafish insan olmayan primatlar, her biri kendi sınırlamaları3,4sahip açıklanmıştır. Duvar modeli, maliyet, doğuştan hatları, enfeksiyon ve immünolojik reaktifler bolluğu tekrarlanabilirlik mevcudiyeti nedeniyle en sık kullanılan modeldir. Ancak, genellikle gizli Tüberküloz enfeksiyonu (LTBI)6karakteristik olan hipoksi alanları ile ilişkili granülomlar oluşturmaz. Gine domuzları MTB enfeksiyonuna son derece hassastır, patolojiler ve insanlarda benzer erken Granülom oluşumu ile, ve aşı testinde yaygın olarak kullanılır; henüz immünolojik reaktiflerin eksikliği bir enfeksiyon modeli olarak kullanımını engelliyor7. Zebrafish küçük boyutu, hızlı üreme ve gelişmiş genetik araçlar nedeniyle erken evre preklinik çalışmalarda büyük ölçekli tarama için uygundur, ancak anatomik ve fizyolojik olarak insanlara farklı ve sadece duyarlı Mycobacterium Marinum enfeksiyonu3. İnsan MTB enfeksiyonu en yakından benzeyen hayvan modelleri insan olmayan primatlar (örn., macaque), ama pahalı ve önemli ölçüde kullanımı sınırlar ciddi etik ve pratik hususlar var8.
Büyük balmumu güvesi veya petek güve böcek larva,Galleria mellonella, bakteriyel ve mantar patojenler çeşitli için bir enfeksiyon modeli olarak giderek daha popüler hale gelmiştir9, ve yeni antimikrobiyal uyuşturucu adayları için bir ekran olarak 10. G. mellonella onun sofistike doğuştan gelen bağışıklık sistemi nedeniyle başarılı bir omurgasız model (hücresel ve humoral savunma oluşur) bu vertebratlar için yapısal ve işlevsel benzerlik yüksek ölçüde hisse11 . Bu hemanositler tarafından patojenlerin phagositoz gibi bağışıklık mekanizmaları içerir (işlevsel olarak memeliler makrophaj ve nötrofiller benzer)12,13, anti-mikrobiyal peptidler üretim ve dolaşım (amper) ve G. mellonella11‘ in hemolymph içinde (mammalin kanına benzer) tamamlayıcı benzeri proteinler. Diğer avantajları9,14, G. mellonella larvaları bir model olarak15 dahil) onların büyük boyutu (20 − 30 mm) kolay manipülasyon ve enfeksiyon sağlar, yanı sıra doku toplama ve analizler için hemolymph, 2) 37 °C ‘ de kolay bakım, insan patojenleri okumak için uyumlu, 3) anesteziye gerek duymadan enjeksiyon ile hassas enfeksiyon, 4) antimikrobiyal ajanların etkinliği, değerlendirme için daha az ilaç kullanılarak değerlendirilebilir, 5) eksikliği memelilerin kullanımına kıyasla etik kısıtlamalar, 6) büyük grup boyutları, daha fazla yeniden Üretilebilirlik sağlayan hayvan modellerine göre kullanılabilir ve 7) enfeksiyon deneyleri için daha kısa saatler gereklidir.
Yeni bir çalışmada, biz G. mellonella Bioluminesans M. Bovis BCG Lux, aşı gerilme ve üye genetiği değiştirilmiş versiyonu tarafından enfeksiyonun patogenezi okuyan için bir yeni enfeksiyon modeli olarak kullanılabilir göstermiştir MTB kompleksi (mtbc)16. G. mellonella daha önce tüberküloz olmayan mikobakteriler (NTM) için bir enfeksiyon modeli olarak kullanıldığında, özellikle M. Marinum ve Mycobacterium abscessus17,18, mtbc kullanarak çalışmalar sınırlıdır Li ve al.16. MTB için bir vekil olarak koruma SEVIYESINDE (CL) 2 ‘ de kullanılabilecek Bioluminesans olmayan patojenik Mikobakteriyel suşlar, patojenik mikobakteriler üzerinde güvenlik ve pratiklik avantajlarını sunar. BCG Luxile enfeksiyonun ardından LARVALARı, TB enfeksiyonu16‘ nın kurulması sırasında doğuştan gelen dokunulmazlığın rolü ile ilgili değerli bilgiler sağlayabilen erken granülom benzeri yapıları geliştirmeye başlar. Buna ek olarak, bu basit omurgasız enfeksiyon modeli, kontrol edilen zorluk ve yeniden üretilebilirlik için birden çok çoğaltır içeren TB patogenezinin hızlı, düşük maliyetli ve güvenilir bir şekilde değerlendirilmesine imkân sağlar. Ayrıca, model, deney hayvanların genel sayısını azaltarak, erken gelişiminde yeni anti-TB ilaç ve aşı adaylarını ekrana kullanılacak potansiyele sahiptir. Ev sahibi ve patojen yapısında, transkriptom ve proteomdaki değişiklikleri, uyuşturucu hedeflerini belirlemek ve yeni ilaçların ve terapötik aşıların eylem mekanizmalarını değerlendirmek için ölçmek yeteneği de avantajlıdır.
Burada, Mikobakteriyel Enfeksiyon için Bioluminesans M. Bovis BCG Lux inokulumunu ve G. mellonella larvaları hazırlanması için deneysel protokoller ve hem larva hem de Mikobakteriyel enfeksiyona yanıt olarak hayatta kalma.
Protocol
Representative Results
Discussion
G. mellonella ‘nın bir enfeksiyon modeli olarak kullanımı, virulence, ana bilgisayar patojen etkileşimi ve yeni terapi10,22için bir ekran olarak bir dizi bakteriyel ve mantar patojenler için kurulmuştur. Aşağıdaki tartışma MTBC için bir enfeksiyon modeli olarak G. mellonella kullanımı için deneysel prosedür dayanmaktadır.
Deneyden önce saf larvaları sağlık, deney sonucu üzerinde önemli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje Biyoteknoloji ve biyolojik Bilim Araştırma Konseyi (BBSRC), PRL ve YL (BB/P001262/1) ve Ulusal Merkezi değiştirme, arıtma ve araştırma hayvanların azaltma (NC3Rs) için verilen hibe tarafından desteklenmektedir PRL, SMN, BDR ve YL (NC/R001596/1).
Materials
| 1.5ml reaction tube (Eppendorf) | Eppendorf | 22431021 | |
| 20, 200 and 1000 µl pipette and filtered tips | Any supplier | n/a | |
| 24 well culture plate | Greiner | 662160 | |
| 25 ml pipettes and pipette boy | Any supplier | n/a | |
| 3 compartment Petri dish (94/15mm) | Greiner | 637102 | |
| Centrifuge | Any supplier | n/a | |
| Class II saftey cabinet | Any supplier | n/a | |
| Erlenmeyer flask with vented cap (250 ml) | Corning | CLS40183 | |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 208221.321 | |
| Galleria mellonella (250 per pk) | Livefood Direct UK | W250 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150 | |
| Homogeniser (FastPrep-24 5G ) | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Hygromycin B | Corning | 30-240CR | |
| Luminometer (Autolumat LB 953) | Berthold | 34622 | |
| Luminometer tubes | Corning | 352054 | |
| Lysing matrix (S, 2.0ml) | MP Biomedicals | 116925500 | |
| Micro syringe (25 µl, 25 ga) | SGE | 3000 | |
| Microcentrifuge | Any supplier | n/a | |
| Middlebrook 7H11 agar | BD Bioscience | 283810 | |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Bioscience | 271310 | |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Bioscience | 212352 | |
| Middlebrook OADC enrichment | BD Bioscience | 212240 | |
| Mycobacterium bovis BCG lux | Various | n/a | |
| n-decyl aldehyde | Sigma-Aldrich | D7384-100G | |
| Orbital shaking incubator | Any supplier | n/a | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P4417-100TAB | |
| Polysorbate 80 (Tween-80) | Sigma-Aldrich | P8074-500ml | |
| Small box | Any supplier | n/a | dark vented or non-sealed box recommended |
| Tweezer | Any supplier | n/a | Short and narrow tipped/Blunt long tweezers |
| Winterm (V1.08) | Berthold | n/a | Program LB953.TTB |
| Petri dish (94/15mm) | Greiner | 633181 | |
| Filter paper (94mm) | Any supplier | n/a | Cut to fit |
References
- World Health Organization. . Global tuberculosis report 2018. , (2018).
- Colditz, G. A., et al. Efficacy of BCG Vaccine in the prevention of tuberculosis: meta-analysis of the published literature. Journal of the American Medical Association. 271 (9), 698-702 (1994).
- Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
- Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine. Frontiers in Microbiology. 8, 717 (2017).
- Gumbo, T., Lenaerts, A. J., Hanna, D., Romero, K., Nuermberger, E. Nonclinical models for antituberculosis drug development: a landscape analysis. Journal of Infectious Diseases. 211 (Suppl 3), S83-S95 (2015).
- Williams, A., Orme, I. M. Animal models of tuberculosis: an overview. Microbiology Spectrum. 4 (4), (2016).
- Myllymäki, H., Niskanen, M., Oksanen, K. E., Rämet, M. Animal models in tuberculosis research – where is the beef?. Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (8), 871-883 (2015).
- Flynn, J. L., Gideon, H. P., Mattila, J. T., Lin, P. L. Immunology studies in non-human primate models of tuberculosis. Immunological Reviews. 264 (1), 60-73 (2015).
- Cook, S. M., McArthur, J. D. Developing Galleria mellonella as a model host for human pathogens. Virulence. 4 (5), 350-353 (2013).
- Tsai, C. J. -. Y., Loh, J. M. S., Proft, T. Galleria mellonella infection models for the study of bacterial diseases and for antimicrobial drug testing. Virulence. 7 (3), 214-229 (2016).
- Wojda, I. Immunity of the greater wax moth Galleria mellonella. Insect Science. 24 (3), 342-357 (2017).
- Browne, N., Heelan, M., Kavanagh, K. An analysis of the structural and functional similarities of insect hemocytes and mammalian phagocytes. Virulence. 4 (7), 597-603 (2013).
- Arteaga Blanco, L. A., et al. Differential cellular immune response of Galleria mellonella to Actinobacillus pleuropneumoniae. Cell and Tissue Research. 370 (1), 153-168 (2017).
- López Hernández, Y., Yero, D., Pinos-Rodríguez, J. M., Gibert, I. Animals devoid of pulmonary system as infection models in the study of lung bacterial pathogens. Frontiers in Microbiology. 6, 38 (2015).
- Ramarao, N., Nielsen-Leroux, C., Lereclus, D. The Insect Galleria mellonella as a powerful infection model to investigate bacterial pathogenesis. Journal of Visualized Experiments. (70), e4392 (2012).
- Li, Y., et al. Galleria mellonella – a novel infection model for the Mycobacterium tuberculosis complex. Virulence. 9 (1), 1126-1137 (2018).
- Meir, M., Grosfeld, T., Barkan, D. Establishment and validation of Galleria mellonella as a novel model organism to study Mycobacterium abscessus infection, pathogenesis, and treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (4), (2018).
- Entwistle, F. M., Coote, P. J. Evaluation of greater wax moth larvae, Galleria mellonella, as a novel in vivo model for non-tuberculosis mycobacteria infections and antibiotic treatments. Journal of Medical Microbiology. 67 (4), 585-597 (2018).
- Snewin, V. A., Gares, M., #211;gaora, P., Hasan, Z., Brown, I. N., Young, D. B. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infection and Immunity. 67 (9), 4586-4593 (1999).
- Newton, S., Martineau, A., Kampmann, B. A functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux). Journal of Visualized Experiments. (55), (2011).
- Jorjão, A. L., et al. From moths to caterpillars: Ideal conditions for Galleria mellonella rearing for in vivo microbiological studies. Virulence. 9 (1), 383-389 (2018).
- Kavanagh, K., Sheehan, G. The use of Galleria mellonella larvae to identify novel antimicrobial agents against fungal species of medical interest. Journal of Fungi. 4 (3), 113 (2018).
- Champion, O., Titball, R., Bates, S. Standardization of G. mellonella larvae to provide reliable and reproducible results in the study of fungal pathogens. Journal of Fungi. 4 (3), 108 (2018).
- Wojda, I., Taszlow, P., Jakubowicz, T. The effect of cold shock on the immune response of the greater wax moth Galleria mellonella after infection with entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis. Journal of Maria Curie-Sklodowska University. 69 (2), 7-18 (2015).
- Nascimento, I. P., Leite, L. C. C. The effect of passaging in liquid media and storage on Mycobacterium bovis – BCG growth capacity and infectivity. FEMS Microbiology Letters. 243 (1), 81-86 (2005).
- De Groote, M. A., et al. Comparative studies evaluating mouse models used for efficacy testing of experimental drugs against Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (3), 1237-1247 (2011).
- Grosset, J., et al. Modeling early bactericidal activity in murine tuberculosis provides insights into the activity of isoniazid and pyrazinamide. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 109 (37), 15001-15005 (2012).
- Vogel, H., Altincicek, B., Glöckner, G., Vilcinskas, A. A comprehensive transcriptome and immune-gene repertoire of the lepidopteran model host Galleria mellonella. BMC Genomics. 12, 308 (2011).
