Verwendung der wirbellosen Galleria mellonella als Infektionsmodell zur Untersuchung des Mycobacterium tuberculosis Complex

Tuberkulose (TB) stellt eine große Bedrohung für die globale öffentliche Gesundheit dar, mit 9 Millionen neuen Fällen pro Jahr und 1,5 Millionen Todesfällen¹. Darüber hinaus wird geschätzt, dass ein Viertel der Weltbevölkerung mit dem Erreger der Krankheit infiziert ist, Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Unter der infizierten Bevölkerung werden 5 bis 10 % im Laufe ihres Lebens eine aktive TB-Krankheit entwickeln. Darüber hinaus stellt das Aufkommen und die Ausbreitung von multiresistentem (MDR) und extensiv-medikamentösem (XDR) resistentem Mtb eine ernste Bedrohung für die Seuchenbekämpfung dar, wobei 123 Länder mindestens einen XDR-Fall^{melden 1}. Die Behandlung von TB erfordert einen Cocktail von mindestens vier antimykobakteriellen Medikamenten, von denen Isoniazid und Rifampicin für eine Mindestdauer von sechs Monaten verschrieben werden; Behandlung ist oft mit komplexen Nebenwirkungen und Toxizitäten verbunden. Der Schutz vor dem einzigen zugelassenen Impfstoff gegen TB, Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), ist variabel². Ein unvollständiges Verständnis der Pathogenese von TB behindert die Entwicklung neuer Therapie- und Impfstrategien erheblich.

Seit Jahrzehnten sind Tierinfektionsmodelle für die TB-Forschung von entscheidender Bedeutung, um die grundlegende Pathogenese und die Wirtsreaktion auf Infektionen zu verstehen und neuartige antimykobakterielle Wirkstoffe, Immuntherapeutika und neue Impfstoffkandidaten zu bewerten^{3, 4}. Die Forschung mit Tierinfektionsmodellen von TB ist jedoch notorisch schwierig, da die Pathogenese und das Fortschreiten der TB-Infektion komplex sind und es kein einzelnes Tiermodell gibt, das das gesamte Spektrum und wichtige Merkmale der Krankheit imitiert^{5 ,6}. Darüber hinaus sind Tierversuche teuer, zeitaufwändig und erfordern eine vollständige ethische Rechtfertigung. Dennoch wurden Tierinfektionsmodelle von TB bei nichtmenschlichen Primaten (z. B. Makaken), Meerschweinchen, Kaninchen, Rindern, Schweinen, Mäusen und Zebrafischen beschrieben, wobei jeder seine Einschränkungen^{hat 3,4}. Das murine Modell ist das am häufigsten verwendete Modell aufgrund von Kosten, Verfügbarkeit von inzuchtlinien, Reproduzierbarkeit der Infektion und Fülle von immunologischen Reagenzien. Sie bilden jedoch in der Regel keine Granulome, die mit Hypoxiegebieten assoziiert sind, die für eine latente Tuberkuloseinfektion (LTBI) charakteristisch sind (LTBI)⁶. Meerschweinchen sind sehr anfällig für Mtb-Infektionen, mit Pathologie und frühe Granulombildung ähnlich denen beim Menschen, und sind weit verbreitet in Impfstofftests verwendet; doch der Mangel an immunologischen Reagenzien behindert ihre Verwendung als Infektionsmodell⁷. Zebrafische eignen sich aufgrund ihrer geringen Größe, schnellen Fortpflanzung und fortgeschrittenen genetischen Werkzeuge für großangelegte Screenings in präklinischen Studien im Frühstadium, sind aber anatomisch und physiologisch verschieden vom Menschen und nur anfällig für Mycobacterium marinum Infektion³. Die Tiermodelle, die der menschlichen Mtb-Infektion am ehesten ähneln, sind nichtmenschliche Primaten (z.B. der Makaken), aber sie sind teuer und haben erhebliche ethische und praktische Überlegungen, die ihre Verwendung erheblich einschränkt⁸.

Die Insektenlarven der größeren Wachsmotte oder Wabenmotte,Galleria mellonella, sind als Infektionsmodell für eine Vielzahl von bakteriellen und Pilzpathogenen⁹und als Bildschirm für neuartige antimikrobielle Wirkstoffkandidaten immer beliebter geworden. ¹⁰. G. mellonella ist ein erfolgreiches Wirbellosenmodell aufgrund seines ausgeklügelten angeborenen Immunsystems (bestehend aus zellulären und humoralen Abwehrmaßnahmen), das einen hohen Grad an struktureller und funktioneller Ähnlichkeit mit dem von Wirbeltieren teilt¹¹ . Dazu gehören Immunmechanismen wie die Phagozytose von Krankheitserregern durch Hämozyten (funktionell ähnlich wie Säugetiermakrophagen und Neutrophile)^12,13, die Produktion und Zirkulation von antimikrobiellen Peptiden (AMPs) und Komplement-ähnliche Proteine innerhalb der Hämolymphe (analog zum Säugetierblut) von G. mellonella¹¹. Weitere Vorteile^9,14,15 von G. mellonella Larven als Modell sind 1) ihre große Größe (20 x 30 mm), die eine einfache Manipulation und Infektion ermöglicht, sowie die Sammlung von Gewebe und Hämolymphe für Analysen, 2) einfache Wartung bei 37 °C, kompatibel zur Untersuchung menschlicher Krankheitserreger, 3) präzise Injektion ohne Anästhesie, 4) Wirksamkeit antimikrobieller Wirkstoffe kann mit weniger Wirkstoff zur Bewertung beurteilt werden, 5) Mangel an ethische Zwänge im Vergleich zur Verwendung von Säugetieren, 6) große Gruppengrößen können im Vergleich zu Tiermodellen verwendet werden, die eine größere Reproduzierbarkeit ermöglichen, und 7) kürzere Zeiten für Infektionsexperimente sind erforderlich.

In einer aktuellen Studie haben wir gezeigt, dass G. mellonella als neuartiges Infektionsmodell zur Untersuchung der Pathogenese von Infektionen durch biolumineszierende M. bovis BCG lux, eine genetisch veränderte Version des Impfstoffstamms und des Mtb-Komplexes (MTBC)¹⁶. Während G. mellonella bisher als Infektionsmodell für nicht-tuberkulöse Mykobakterien (NTM) verwendet wurde, sind vor allem M. marinum und Mycobacterium abscessus^17,18, Studien mit MTBC auf die von Li et al.¹⁶. Biolumineszierende nichtpathogene mykobakterielle Stämme, die auf Containment-Ebene (CL) 2 als Ersatz für Mtb eingesetzt werden können, bieten die Vorteile von Sicherheit und Praktikabilität gegenüber pathogenen Mykobakterien. Nach der Infektion mit BCG luxbeginnen Larven, frühe granulomähnliche Strukturen zu entwickeln, die wertvolle Einblicke in die Rolle der angeborenen Immunität bei der Etablierung einer TB-Infektion bieten könnten¹⁶. Darüber hinaus hat dieses einfache Modell für wirbellose Infektionen das Potenzial, eine schnelle, kostengünstige und zuverlässige Bewertung der TB-Pathogenese zu ermöglichen, die eine kontrollierte Herausforderung und mehrere Replikationen zur Reproduzierbarkeit umfasst. Darüber hinaus hat das Modell das Potenzial, in der frühen Entwicklung neue Anti-TB-Medikamente und Impfstoffkandidaten zu testen, wodurch die Gesamtzahl der Versuchstiere reduziert wird. Die Fähigkeit, Veränderungen in der Wirts- und Pathogenstruktur, Transkriptom und Proteom zu messen, um Arzneimittelziele zu bestimmen und Wirkmechanismen neuartiger Medikamente und therapeutischer Impfstoffe zu bewerten, ist ebenfalls von Vorteil.

Hier beschreiben wir die experimentellen Protokolle zur Herstellung eines biolumineszierenden M. bovis BCG lux inoculum und G. mellonella larven für mykobakterielle Infektionen, sowie die Bestimmung von Larven und mykobakteriellen Überleben als Reaktion auf eine Infektion.