Summary

לומדת אורגל דינמיקה ב-B תאים במהלך היווצרות סינפסה החיסונית

Published: June 01, 2019
doi:

Summary

כאן אנו מתארים שתי גישות כדי לאפיין את האירועים הקיטוב התא ב לימפוציטים B במהלך היווצרות של IS. הראשון, כולל כימות של גיוס והשלד של ארגון מחדש על הקרום סינפטית. השני הוא גישה ביוכימית, כדי לאפיין שינויים בקומפוזיציה של הסנטרוחלק, אשר עובר קיטוב לסינפסה החיסונית.

Abstract

הכרה של משטח קשור אנטיגנים על ידי קולטן התא B (BCR) מפעיל את היווצרות סינפסה החיסונית (IS), שבו הן ספיגת איתות ו אנטיגן מתואמים. היא היווצרות כולל שיפוץ דינאמי אקטין מלווה גיוס מקוטב לקרום סינפטית של הסנטרוחלק והקשורים לאורגולאים תאיים כגון ליסוזומים ומערכת golgi. בשלבים הראשוניים של שיפוץ אקטין לאפשר לתאי B להגדיל את משטח התא שלהם ולמקסם את כמות אנטיגן-bcr מכלולי התאספו בסינפסה. בתנאים מסוימים, כאשר B תאים מזהים אנטיגנים הקשורים משטחים נוקשים, תהליך זה משולב לגיוס המקומי הפרשה של lysosomes, אשר יכול להקל על החילוץ אנטיגן. אנטיגנים uptaken הם הפנימו לתוך המקצועית ליסוכמה תאים לעיבוד לתוך פפטידים, אשר נטענים על הגדול ביותר היסטוליםקומפלקס מורכבים II (MHC-II) מולקולות עבור מצגת נוספת תאים מסייע T. לכן, לימוד דינמיקה של ארגון הקשור להיווצרות IS הוא חיוני כדי להבין כיצד התאים B מופעלים. במאמר הנוכחי נדון הן בהדמיה והן בטכניקה ביוכימית המשמשת לחקר שינויים במיקום של מיצוב מאורגני ובשלד ציטותאי המשויכים להיווצרות הנמצא בתאי B.

Introduction

לימפוציטים B הם חלק חיוני של המערכת החיסונית אדפטיבית אחראי להפקת נוגדנים נגד איומים שונים והפולשים פתוגנים. היעילות של ייצור נוגדנים נקבעת על ידי היכולת של B תאים כדי לרכוש, התהליך והנוכחי אנטיגנים נתקל או בטופס מסיסים או קשור למשטח1,2. הכרה של אנטיגנים המחוברים אל פני השטח של תא מציג, על ידי bcr, מוביל היווצרות של מגע התרבות קרוב שנקרא הוא3,4. בתוך פלטפורמת דינמי זה הן BCR תלוי במורד הזרם איתות הפנמה של אנטיגנים לתוך אנדו-lysosome תאים מתרחש. אנטיגנים uptaken מעובדים והתאספו על מולקולות MHC-II ולאחר מכן הציגו לימפוציטים T. אינטראקציות ה-B-T פרודוקטיבי, כינה את שיתוף הפעולה של תא B-T, לאפשר B לימפוציטים לקבל את האותות המתאימים, אשר לקדם את הבידול שלהם לתוך מייצרת נוגדנים תאי פלזמה או תאים זיכרון8.

שני מנגנונים היו מעורבים בהפקת אנטיגן על ידי תאי B. הראשון מסתמך על הפרשת הפרוטסים שמקורם ליסוזומים העוברים גיוס והיתוך ב סינפטית שסועה5,6. השני, תלוי ברירן IIA-תיווך מושך כוחות שמפעיל את הפולשים של אנטיגן המכיל ממברנות אשר הפנימו לתוך בורות מצופה clathrin7. המצב של הפקת אנטיגן מסתמך על המאפיינים הפיזיים של קרום שבו אנטיגנים מצויים. אף על פי כן, בשני המקרים, תאי B עוברים שני אירועי שיפוץ עיקריים: התארגנות מארגון השלד הציטומה ופולריזציה של אורגלים ל-IS. השלד הפנימי של actin שיפוצים כרוך שלב התפשטות ראשונית, שם actin תלוי בליטות בקרום סינפטית להגדיל את פני השטח במגע עם האנטיגן. הדבר מלווה בשלב התכווצות, שבו BCRs בשילוב עם אנטיגנים מרוכזים במרכז של זה על ידי פעולה מתואמת של מנועים מולקולריים אקטין שלד מעצב שיפוץ8,9,10, 11. פולריזציה של אורגלים מסתמך גם על שיפוץ של שלד ציטוטין. למשל, הסנטרוחלק הופך להיות בלתי משולב מן הגרעין, על ידי הדפלוניזציה המקומית של actin הקשורים, אשר מאפשר את מיקום מחדש של האורגאל הזה הוא5,12. ב-B תאים, מיקום מחדש של הסנטרוחלק לקוטב תא אחד (IS) מדריכים לגיוס לקרום סינפטית, אשר על הפרשה יכול להקל על החילוץ ו/או עיבוד של אנטיגנים הקשור למשטח6. ליסוזומים שגויס ב IS מועשר עם MHC-II, אשר מעדיף היווצרות של פפטיד-MHC-II מכלולי בתאי אנדוזומבית להיות מוצגים T תאים13. בנוסף, מערכת Golgi נצפתה גם להיות מגויס היטב ל-IS14, הרומז כי golgi נגזר שלפוחיות מן השביל הסוד יכול להיות מעורב בהפקת אנטיגן ו/או עיבוד.

בסך הכל, מארגני התאיים והשלד הציטותאים בתאי B במהלך היווצרות סינפסה הם הצעדים העיקריים המאפשרים רכישת אנטיגן יעיל עיבוד נדרש עבור הפעלה נוספת שלהם. בעבודה זו אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים על איך לבצע הדמיה וניתוח ביוכימיים בתאי B ללמוד שיפוץ תאיים של אורגלים הקשורים היווצרות של IS. טכניקות אלה כוללות: (i) Immunofluorescence ניתוח תמונה של תאי B המופעל עם מחרוזת אנטיגן מצופה, על הכיסויים אנטיגן מצופה, אשר מאפשר הדמיה וכימות של רכיבים תאיים המגייסו ל IS ו (ii ) בידוד של מספר שברים מועשר ב-B בתאי על ידי הסתבכות על מעברי הצבע של סוכרוז, המאפשר זיהוי של חלבונים הקשורים ל-centrosome העלולים להיות מעורבים בוויסות קוטביות התא.

Protocol

הערה: השלבים הבאים בוצעו באמצעות IIA 1.6 B תאים. 1. B הפעלת תא עם חרוזים מצופי אנטיגן הכנת חרוזים מצופי אנטיגן כדי להפעיל תאים B, השתמש ב-NH2חרוזים מצופה בשמן עם אנטיגן (מצופה Ag), אשר מוכנים באמצעות 50 μl (~ 20 x 106 חרוזים) של 3 יקרומטר NH2חרוזים עם הפעלת (bcr-ligand +) או ?…

Representative Results

המאמר הנוכחי מראה כיצד התאים B יכול להיות מופעל באמצעות אנטיגן קיבוע על חרוזים או coverslips כדי לגרום להיווצרות של IS. אנו מספקים מידע על כיצד לזהות ולכמת את הקיטוב של מארגני שונים על ידי מערכת חיסונית וכיצד לאפיין חלבונים העוברים שינויים דינמיים בהתאגדות שלהם לסנטרוחלק, אשר ?…

Discussion

אנו מתארים שיטה מקיפה ללמוד כיצד B לימפוציטים לארגן מחדש את הארכיטקטורה תאיים שלהם כדי לקדם את היווצרות של IS. מחקר זה כולל את השימוש בטכניקות הדמיה כדי לכמת את התפלגות תאיים של אורגלים, כגון centrosome מכשירים Golgi ו-lysosomes במהלך הפעלת התא B, וכיצד הם הקיטוב כדי IS. בנוסף, אנו מתארים גישה ביוכימית ללי?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.-I.Y. נתמך על ידי מענק מחקר מ FONDECYT1180900. J.I., D.F ו J.L. היו נתמכים על ידי מלגות מתוך האינטרנציונל הלאומי. אנו מודים לדוד אוסוריו מאוניברסיצ קאנוקיה דה צ’ילה להקלטת וידאו ולעריכה.

Materials

IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells ATCC TIB-208 Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR
100% methanol Fisher Scientific A412-4
10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular Marienfield-Superior 111500
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023
Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG  LifeTech  A21206 1:500 dilution recomended but should be optimized
Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit  IgG Thermo Fisher Scientific  A-11071 1:500 dilution recomended but should be optimized
Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin Thermo Fisher Scientific  A21238 1:500 dilution recomended but should be optimized
Amaxa Nucleofection kit V Lonza VCA-1003 Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA
Amaxa Nucleofector model 2b Lonza AAB-1001 Program L-013 used
Amino- Dynabeads ThermoFisher 14307D
Anti-pericentrin  Abcam ab4448  1:200 dilution recomended but should be optimized
Anti-rab6 Abcam ab95954 1:200 dilution recomended but should be optimized
Anti-sec61 Abcam ab15575 1:200 dilution recomended but should be optimized
BSA  Winkler  BM-0150
CaCl2 Winkler CA-0520
Culture plate T25 BD 353014
Fiji Software Fiji col.
Fluoromount G Electron Microscopy Science 17984-25
Glutamine Thermo Fisher Scientific 35050061
Glutaraldehyde Sigma  G7651 
Glycine Winkler  BM-0820
Goat-anti-mouse IgG antibody Jackson ImmunoResearch 315-005-003 IIA1.6 positive ligand
Goat-anti-mouse IgM antibody Thermo Fisher Scientific 31186 IIA1.6 negative ligand
HyClone Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific SH30071.03 Heat inactivate at 56 oC for 30 min
KCl Winkler PO-1260
Leica SP8 TCS microscope Leica
NaCl Winkler SO-1455
Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope  Nikon
Parafilm M P1150-2
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4 Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Liquid
Polybead Amino Microspheres 3.00μm Polyscience 17145-5
Poly-L-Lysine Sigma P8920 Dilute with sterile water
Rabbit anti- alpha tubulin antibody Abcam ab6160 1:1000 dilution recommended but should be optimized
Rabbit anti mouse lamp1 antibody Cell signaling 3243 1:200 dilution recomended but should be optimized
Rabbit anti-cep55  Abcam ab170414 1:500 dilution recomended but should be optimized
Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody  Abcam ab16504  1:1000 for Western Blot
RPMI-1640 Biological Industries 01-104-1A
Saponin  Merck 558255
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360070
Sucrose Winkler  SA-1390 
Triton X-100  Merck 9036-19-5
Tube 50 ml Corning 353043

References

  1. Carrasco, Y. R., Batista, F. D. B. Cells Acquire Particulate Antigen in a Macrophage-Rich Area at the Boundary between the Follicle and the Subcapsular Sinus of the Lymph Node. Immunity. 27 (1), 160-171 (2007).
  2. Batista, F. D., Harwood, N. E. The who, how and where of antigen presentation to B cells. Nature Reviews Immunology. 9 (1), 15-27 (2009).
  3. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science (New York, N.Y.). 285 (5425), 221-227 (1999).
  4. Batista, F. D., Iber, D., Neuberger, M. S. B cells acquire antigen from target cells after synapse formation. Nature. 411 (6836), 489-494 (2001).
  5. Obino, D., et al. Actin nucleation at the centrosome controls lymphocyte polarity. Nature Communications. 7, (2016).
  6. Yuseff, M. I., et al. Polarized Secretion of Lysosomes at the B Cell Synapse Couples Antigen Extraction to Processing and Presentation. Immunity. 35 (3), 361-374 (2011).
  7. Spillane, K. M., Tolar, P. Mechanics of antigen extraction in the B cell synapse. Molecular Immunology. 101, 319-328 (2018).
  8. Schnyder, T., et al. B Cell Receptor-Mediated Antigen Gathering Requires Ubiquitin Ligase Cbl and Adaptors Grb2 and Dok-3 to Recruit Dynein to the Signaling Microcluster. Immunity. , (2011).
  9. Wang, J. C., et al. The Rap1 – cofilin-1 pathway coordinates actin reorganization and MTOC polarization at the B cell immune synapse. Journal of Cell Science. , 1094-1109 (2017).
  10. Fleire, S. J., Goldman, J. P., Carrasco, Y. R., Weber, M., Bray, D., Batista, F. D. B cell ligand discrimination through a spreading and contraction response. Science. 312 (5774), 738-741 (2006).
  11. Vascotto, F., et al. The actin-based motor protein myosin II regulates MHC class II trafficking and BCR-driven antigen presentation. Journal of Cell Biology. 176 (7), 1007-1019 (2007).
  12. Reversat, A., et al. Polarity protein Par3 controls B-cell receptor dynamics and antigen extraction at the immune synapse. Molecular biology of the cell. 26 (7), 1273-1285 (2015).
  13. Lankar, D., et al. Dynamics of Major Histocompatibility Complex Class II Compartments during B Cell Receptor–mediated Cell Activation. The Journal of Experimental Medicine. 195 (4), 461-472 (2002).
  14. Duchez, S., et al. Reciprocal Polarization of T and B Cells at the Immunological Synapse. The Journal of Immunology. 187 (9), 4571-4580 (2011).
  15. Pérez-Montesinos, G., et al. Dynamic changes in the intracellular association of selected rab small GTPases with MHC class II and DM during dendritic cell maturation. Frontiers in Immunology. 8 (MAR), 1-15 (2017).
  16. Le Roux, D., Lankar, D., Yuseff, M. I., Vascotto, F., Yokozeki, T., Faure-Andre´, G., Mougneau, E., Glaichenhaus, N., Manoury, B., Bonnerot, C., Lennon-Dume´nil, A. M. Syk-dependent Actin Dynamics Regulate Endocytic Trafficking and Processing of Antigens Internalized through the B-Cell Receptor. Molecular biology of the cell. 18 (September), 3451-3462 (2007).
  17. Reber, S. Chapter 8 Isolation of Centrosomes from Cultured Cells. Methods in Molecular Biology. 777 (2), 107-116 (2011).
  18. Gogendeau, D., Guichard, P., Tassin, A. M. Purification of centrosomes from mammalian cell lines. Methods in Cell Biology. 129, (2015).
  19. Obino, D., et al. Vamp-7–dependent secretion at the immune synapse regulates antigen extraction and presentation in B-lymphocytes. Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 890-897 (2017).
  20. Harwood, N. E., Batista, F. D. Early Events in B Cell Activation BCR: B cell receptor. Annual Review of Immunology. , (2010).
  21. Yuseff, M. I., Lennon-Duménil, A. M. B cells use conserved polarity cues to regulate their antigen processing and presentation functions. Frontiers in Immunology. 6, 1-7 (2015).

Play Video

Cite This Article
Ibañez-Vega, J., Fuentes, D., Lagos, J., Cancino, J., Yuseff, M. I. Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation. J. Vis. Exp. (148), e59621, doi:10.3791/59621 (2019).

View Video