Summary

Étudier la dynamique d'Organelle dans les cellules B pendant la formation immunitaire de synapse

Published: June 01, 2019
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Summary

Ici nous décrivons deux approches pour caractériser des événements de polarisation de cellules dans les lymphocytes de B pendant la formation d’un IS. La première, implique la quantification du recrutement d’organites et des réarrangements de cytosquelette à la membrane synaptique. La seconde est une approche biochimique, pour caractériser les changements dans la composition du centrosome, qui subit une polarisation à la synapse immunitaire.

Abstract

La reconnaissance des antigènes attachés de surface par le récepteur des cellules B (BCR) déclenche la formation d’une synapse immunitaire (IS), où la signalisation et l’apport d’antigènes sont coordonnés. La formation d’IS implique le remodelage dynamique d’actine accompagné du recrutement polarisé à la membrane synaptique des organites intracellulaires centrosomes et associés tels que des lysosomes et l’appareil de Golgi. Les premières étapes du remodelage de l’actine permettent aux cellules B d’augmenter leur surface cellulaire et de maximiser la quantité de complexes antigènes-BCR recueillis à la synapse. Dans certaines conditions, lorsque les cellules B reconnaissent les antigènes associés aux surfaces rigides, ce processus est couplé au recrutement local et à la sécrétion de lysosomes, ce qui peut faciliter l’extraction d’antigènes. Les antigènes pris sont intériorisés dans des compartiments endo-lysosome spécialisés pour le traitement en peptides, qui sont chargés sur des molécules majeures du complexe d’histocompatibilité II (MHC-II) pour une présentation ultérieure aux cellules d’aide T. Par conséquent, l’étude de la dynamique des organites associée à la formation d’un SI est cruciale pour comprendre comment les cellules B sont activées. Dans le présent article, nous discuterons à la fois de l’imagerie et d’une technique biochimique utilisée pour étudier les changements dans le positionnement intracellulaire des organites et les réarrangements cytosquelettes qui sont associés à la formation d’un IS dans les cellules B.

Introduction

Les lymphocytes B sont une partie essentielle du système immunitaire adaptatif responsable de la production d’anticorps contre différentes menaces et d’envahissement des agents pathogènes. L’efficacité de la production d’anticorps est déterminée par la capacité des cellules B à acquérir, traiter et présenter les antigènes rencontrés sous une forme soluble ou en surface1,2. La reconnaissance des antigènes attachés à la surface d’une cellule de présentation, par le BCR, conduit à la formation d’un contact intercellulaire étroit appelé IS3,4. Dans cette plate-forme dynamique, la signalisation en aval dépendante de BCR et l’internalisation des antigènes dans les compartiments endo-lysosome ont lieu. Les antigènes pris sont traités et assemblés sur des molécules MHC-II et ensuite présentés aux lymphocytes T. Les interactions productives B-T, appelées coopération de cellules B-T, permettent aux lymphocytes B de recevoir les signaux appropriés, qui favorisent leur différenciation en cellules plasmatiques productrices d’anticorps ou cellules de mémoire8.

Deux mécanismes ont été impliqués dans l’extraction d’antigènes par les cellules B. La première s’appuie sur la sécrétion de protéases issues de lysosomes qui subissent le recrutement et la fusion à la fente synaptique5,6. Le second, dépend des forces de traction Myosin IIA-négociées qui déclenche l’invagination de l’antigène contenant des membranes qui sont intériorisées dans des fosses enduites de clathrine7. Le mode d’extraction d’antigènes repose sur les propriétés physiques de la membrane dans laquelle se trouvent les antigènes. Néanmoins, dans les deux cas, les cellules B subissent deux événements majeurs de remodelage : la réorganisation du cytosquelette d’actine et la polarisation des organites à l’IS. Le remodelage du cytosquelette d’Actin implique une étape initiale de propagation, où les protubérances actin-dépendantes à la membrane synaptique augmentent la surface en contact avec l’antigène. Elle est suivie d’une phase de contraction, où les BCR couplés avec des antigènes sont concentrés au centre de l’IS par l’action concertée des moteurs moléculaires et de cytosquelette d’actine transformant8,9,10, 11. La polarisation des organites repose également sur le remodelage du cytosquelette d’actine. Par exemple, le centrosome se découple du noyau, par dépolymérisation locale de l’actine associée, ce qui permet le repositionnement de cette organite à l’IS5,12. Dans les cellules B, le repositionnement du centrosome à un pôle cellulaire (IS) guide le recrutement lysosome à la membrane synaptique, qui sur la sécrétion peut faciliter l’extraction et/ou le traitement des antigènes de surface6. Les lysosomes recrutés à l’EI sont enrichis de MHC-II, qui favorise la formation de complexes peptide-MHC-II dans des compartiments endosomal s’ils seront présentés aux lymphocytes T13. En outre, l’appareil Golgi a également été observé pour être étroitement recruté à l’IS14, suggérant que les vésicules golgi-dérivées de la voie sécrétrice pourraient être impliquées dans l’extraction et/ou le traitement d’antigène.

Au total, les réarrangements intracellulaires d’organelle et de cytosquelette dans les cellules De B pendant la formation de synapse sont les étapes principales qui permettent l’acquisition et le traitement efficaces d’antigène exigés pour leur activation plus loin. Dans ce travail, nous introduisons des protocoles détaillés sur la façon d’effectuer l’imagerie et l’analyse biochimique dans les cellules B pour étudier le remodelage intracellulaire des organites associés à la formation d’un IS. Ces techniques comprennent : (i) Immunofluorescence et analyse d’image des cellules B activées avec des perles enduites d’antigène et sur des couvertures enduites d’antigène, ce qui permet la visualisation et la quantification des composants intracellulaires qui sont mobilisés vers l’IS et (ii ) l’isolement des fractions centrosome-enrichies dans les cellules De B par ultracentrifugation sur des gradients de saccharose, qui permet l’identification des protéines liées au centrosome, potentiellement impliquées dans la régulation de la polarité cellulaire.

Protocol

REMARQUE : Les étapes suivantes ont été exécutées utilisant des cellules IIA1.6 B. 1. Activation des cellules B avec perles enduites d’antigène Préparation de perles enduites d’antigène Pour activer les cellules B, utilisez des perles NH2-covalentes enduites d’antigène (perles enduites d’Ag), qui sont préparées à l’aide de 50 l (20 x 106 perles) de 3 m NH2-perles avec activation (BCR-ligand) ou non-activation (BCR-ligand-) antigènes…

Representative Results

Le présent article montre comment les cellules B peuvent être activées à l’aide d’antigène immobilisé sur des perles ou des couvertures pour induire la formation d’un IS. Nous fournissons des informations sur la façon d’identifier et de quantifier la polarisation des différents organites par immunofluorescence et comment caractériser les protéines qui subissent des changements dynamiques dans leur association au centrosome, qui polarise à l’IS, en utilisant un l’approche biochi…

Discussion

Nous décrivons une méthode complète pour étudier comment les lymphocytes B réorganisent leur architecture intracellulaire pour favoriser la formation d’un IS. Cette étude comprend l’utilisation de techniques d’imagerie pour quantifier la distribution intracellulaire des organites, tels que le centrosome, l’appareil Golgi et les lysosomes pendant l’activation des cellules B, et comment ils se polarisent vers l’IS. En outre, nous décrivons une approche biochimique pour étudier des changements dans la composition de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

M.-I.Y. bénéficie d’une subvention de recherche de FONDECYT #1180900. J.I., D.F. et J.L. ont été soutenus par des bourses de la Comision Nacional de Ciencia y Tecnologa. Nous remercions David Osorio de Pontificia Universidad Cataliica de Chile pour l’enregistrement et le montage vidéo.

Materials

IIA1.6 (A20 variant) mouse B-lymphoma cells ATCC TIB-208 Murine B-cell lymphoma of Balb/c origin that expresses an IgG-containing BCR on its surface without FcγIIR
100% methanol Fisher Scientific A412-4
10-mm diameter cover glasses thickness No. 1 circular Marienfield-Superior 111500
2-mercaptoethanol Thermo Fisher Scientific 21985023
Alexa 488 fluor- donkey ant-rabbit IgG  LifeTech  A21206 1:500 dilution recomended but should be optimized
Alexa Fluor 546 goat anti-Rabbit  IgG Thermo Fisher Scientific  A-11071 1:500 dilution recomended but should be optimized
Alexa Fluor 647-conjugated phalloidin Thermo Fisher Scientific  A21238 1:500 dilution recomended but should be optimized
Amaxa Nucleofection kit V Lonza VCA-1003 Follow the manufacturer's directions for mixing the transfection reagents with the DNA
Amaxa Nucleofector model 2b Lonza AAB-1001 Program L-013 used
Amino- Dynabeads ThermoFisher 14307D
Anti-pericentrin  Abcam ab4448  1:200 dilution recomended but should be optimized
Anti-rab6 Abcam ab95954 1:200 dilution recomended but should be optimized
Anti-sec61 Abcam ab15575 1:200 dilution recomended but should be optimized
BSA  Winkler  BM-0150
CaCl2 Winkler CA-0520
Culture plate T25 BD 353014
Fiji Software Fiji col.
Fluoromount G Electron Microscopy Science 17984-25
Glutamine Thermo Fisher Scientific 35050061
Glutaraldehyde Sigma  G7651 
Glycine Winkler  BM-0820
Goat-anti-mouse IgG antibody Jackson ImmunoResearch 315-005-003 IIA1.6 positive ligand
Goat-anti-mouse IgM antibody Thermo Fisher Scientific 31186 IIA1.6 negative ligand
HyClone Fetal bovine serum Thermo Fisher Scientific SH30071.03 Heat inactivate at 56 oC for 30 min
KCl Winkler PO-1260
Leica SP8 TCS microscope Leica
NaCl Winkler SO-1455
Nikon Eclipse Ti-E epifluorescence microscope  Nikon
Parafilm M P1150-2
Paraformaldehyde Merck 30525-89-4 Dilute to 4% with PBS in a safety cabinet, use at the moment
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 Liquid
Polybead Amino Microspheres 3.00μm Polyscience 17145-5
Poly-L-Lysine Sigma P8920 Dilute with sterile water
Rabbit anti- alpha tubulin antibody Abcam ab6160 1:1000 dilution recommended but should be optimized
Rabbit anti mouse lamp1 antibody Cell signaling 3243 1:200 dilution recomended but should be optimized
Rabbit anti-cep55  Abcam ab170414 1:500 dilution recomended but should be optimized
Rabbit Anti-gamma Tubulin antibody  Abcam ab16504  1:1000 for Western Blot
RPMI-1640 Biological Industries 01-104-1A
Saponin  Merck 558255
Sodium pyruvate Thermo Fisher Scientific 11360070
Sucrose Winkler  SA-1390 
Triton X-100  Merck 9036-19-5
Tube 50 ml Corning 353043

References

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Cite This Article
Ibañez-Vega, J., Fuentes, D., Lagos, J., Cancino, J., Yuseff, M. I. Studying Organelle Dynamics in B Cells During Immune Synapse Formation. J. Vis. Exp. (148), e59621, doi:10.3791/59621 (2019).

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