Modèle d'impact cortical contrôlé des dommages de cerveau de souris avec la transplantation thérapeutique des cellules neurales pluripotentes induites par l'homme de cellules souches
Summary
Ce protocole démontre des méthodologies pour un modèle de souris des dommages traumatiques de cerveau de crâne ouvert et de la transplantation des cellules pluripotentes pluripotentes de cellules souches induites cultivées dans le site de blessure. Les essais comportementaux et histologiques des résultats de ces procédures sont également décrits en bref.
Abstract
Les lésions cérébrales traumatiques (ITC) sont l’une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde. La pathologie de la maladie due à l’ITC progresse de l’insulte mécanique primaire aux processus secondaires de dommages, y compris l’apoptose et l’inflammation. La modélisation animale a été utile dans la recherche pour démêler les mécanismes de blessures et évaluer les thérapies neuroprotectrices potentielles. Ce protocole décrit le modèle d’impact cortical contrôlé (ICC) de TBI focal à tête ouverte. Plus précisément, des paramètres pour produire une blessure corticale unilatérale douce sont décrits. Les conséquences comportementales de l’ICC sont analysées à l’aide du test d’élimination du ruban adhésif de l’intégration sensorimotrice bilatérale. En ce qui concerne la thérapie expérimentale pour la pathologie de TBI, ce protocole illustre également un processus pour transplanter des cellules cultivées dans le cerveau. Les cultures de cellules neurales dérivées des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSCs) ont été choisies pour leur potentiel pour montrer la restauration fonctionnelle supérieure dans les patients humains de TBI. La survie chronique des hiPSCs dans le tissu de cerveau de souris d’hôte est détectée utilisant un processus immunohistochemical modifié de DAB.
Introduction
Les lésions cérébrales traumatiques (ITT) sont un terme général dénonçant les lésions acquises au cerveau en raison de forces mécaniques indirectes (accélération/décélération ou contre-coup) de coups à la tête ou de dommages directs causés par des objets ou des ondes de souffle. TBI a été estimé à être la cause d’environ 9% des décès dans le monde et observé dans environ 50 millions de cas par an1,2. Un rapport 2017 des Centers for Disease Control and Prevention a estimé qu’en 2013, il y avait un total de 2,8 millions de visites à l’hôpital et de décès dus à l’ITC aux États-Unis3. De nombreux TTB plus légers ne sont pas déclarés chaque année. TBI grave peut mener à l’affaiblissement à vie de la cognition, de la fonction motrice, et de la qualité globale de vie. Les conséquences de l’ITC léger, en particulier le TBI répétitif lié au sport, n’ont été appréciées que récemment pour leurs effets insidieux sur la santé4,5.
La modélisation préclinique est un élément essentiel du développement de nouvelles connaissances mécanistes et d’une thérapie réparatrice potentielle pour le TBI. Le modèle d’impact cortical contrôlé (ICC) de TBI est un modèle à tête ouverte de dommages mécaniques de contusion au cortex. Les paramètres d’impact peuvent être modifiés pour produire des blessures de l’ICC qui vont de légères à sévères6. Les blessures de l’ICC sont focales plutôt que diffuses, comme on le voit avec d’autres modèles fermés de TBI. L’ICC peut être effectuée pour induire une blessure unilatérale, de sorte que le cortex contralatéral peut servir de comparateur interne. Ce protocole démontre les caractéristiques d’un CCI doux à une partie du cortex qui englobe les régions somatosensorielles et motrices primaires. Cette zone corticale a été choisie pour son implication dans les comportements sensorimoteurs pour lesquels de nombreux tests de comportement peuvent détecter les déficits induits par les blessures7. Des améliorations comportementales dues aux interventions thérapeutiques pour tBI peuvent également être détectées.
Une caractéristique de TBI est le dysfonctionnement neural répandu dans la région blessée. Les neurones blessés subissent la mort cellulaire, et la connectivité réseau neuronale est perturbée8,9. TBI perturbe le recrutement de cellules souches endogènes, ce qui conduit à d’autres déficits de comportement en aval10,11. La transplantation de cellules souches neurales et de cellules dérivées de cellules souches a été explorée comme possibilité de rétablir la fonction dans le cerveau blessé. En plus du potentiel de reconstituer les circuits neuronaux endommagés, les cellules transplantées exercent des effets paracrine qui favorisent la survie neuronale et la récupération fonctionnelle de TBI12. Une variété de types de cellules ont été transplantés preclinically pour évaluer leur potentiel réparateur dans des modèles des désordres neurologiques13,14,15. La popularisation récente de la technologie des cellules souches pluripotentes induites16 a facilité le développement de nombreuses lignées de cellules souches humaines à des fins expérimentales. L’essai préclinique avec des cellules hiPSC-dérivées est une première étape importante pour caractériser l’efficacité thérapeutique potentielle d’une lignée de cellules donnée contre des maladies humaines. Ce laboratoire a développé des protocoles pour différencier les hiPSC aux phénotypes neuronaux17 à la poursuite de cellules transplantables pour faciliter le rétablissement des lésions cérébrales traumatiques.
Les expériences dans ce protocole emploient un CCI unilatéral pour induire TBI au cortex somatosensory et moteur gauche des souris adultes. Une blessure légère d’ICC a comme conséquence un déficit fonctionnel soutenu dans le avant-paw droit qui est employé pour suivre les effets de l’engraftment de cellules neurales hiPSC-dérivé sur la récupération fonctionnelle. Les essais sensorimoteurs de forepaw dans ce protocole ont été adaptés de la méthodologie établie par Bouet et ses collègues18 et démontrée précédemment par Fleming et ses collègues19. Ce protocole décrit un flux de travail complet pour effectuer une lésion cérébrale expérimentale, la transplantation thérapeutique des cellules hiPS, et l’analyse comportementale et histologique des mesures expérimentales de résultats.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’ICC légère comme système modèle pour tester la thérapie régénérative expérimentale
Le modèle de l’ICC est un outil précieux pour étudier les mécanismes de dysfonctionnement tissulaire après des blessures mécaniques au cortex. L’adabilité des paramètres de blessure est une caractéristique attrayante de ce modèle. Modifier la profondeur d’impact Z, la vitesse ou le temps d’occupation peut augmenter ou diminuer la gravité de la blessure comme le souhaite l’enquêteur<sup class="xref…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été soutenus par une subvention du Center for Neuroscience and Regenerative Medicine (CNRM, numéro de subvention G170244014). Nous apprécions l’aide de Mahima Dewan et Clara Selbrede dans les études pilotes d’enlèvement d’adhésif. Kryslaine Radomski a effectué des lésions cérébrales préliminaires et des chirurgies de transplantation cellulaire. Amanda Fu et Laura Tucker, du laboratoire de base des études précliniques de l’USU CNRM, ont fourni des conseils précieux sur les chirurgies animales et les tests de comportement, respectivement.
Materials
| 1 ml syringes | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| 1.7 ml flip top test tubes | Denville | C2170 | |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide syringe needles | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
| 70% ethanol | Product of choice; varies by region | ||
| acetaminophen oral suspension | Tylenol (Children's) | Dilute to 1 mg/ml in water | |
| anesthetic vaporizer | Vetland | 521-11-22 | |
| animal handling cloth | Purchase from department store | ||
| Betadine | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
| compressed oxygen | Product of choice; varies by region | ||
| cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB staining kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| electrical tape | 3M Corporation | Purchase from department store | |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 – K.107018 | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| lab bench timers | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Micropipette puller | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Any puller will suffice |
| Microscope cover slips | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Microscope slide mounting medium | Product of choice | ||
| mirror | Purchase from department store | ||
| mouse anti-human nuclear antigen antibody | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| needle holder hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| ophthalmic ointment | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| ophthalmic spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| plastic box | Purchase from department store | ||
| plastic cylinder | Purchase from department store | ||
| QSI motorized syringe pump | Stoelting | 53311 | |
| Removable needle compression fitting | Hamilton | 55750-01 | |
| small rodent stereotaxic frame | Stoelting | 51925 | |
| small scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
| Sterile alcohol prep pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| sterile cotton swabs/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Sterile saline | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Stopwatches (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold microscope slides | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| sutures – 5.0 silk with curved needle | Oasis | MV-682 |
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