מבוקרת מודל השפעה בקליפת המוח של פגיעה במוחו של העכבר עם השתלת הטיפולית של האדם המושרה Pluripotent תא גזע תאים הנגזרים
Summary
פרוטוקול זה מדגים מתודולוגיות עבור מודל העכבר של פגיעה במוח הגולגולת טראומה טראומטית השתלת הגוף האנושי המושרה pluripotent שפעה התאים הנגזר לתוך האתר פציעה. מבחנים התנהגותיים והיסטולוגיים של תוצאות מהליכים אלה מתוארים גם בקצרה.
Abstract
פגיעה מוחית טראומטית (TBI) היא גורם מוביל לתחלואה ותמותה ברחבי העולם. פתולוגיה של מחלות בשל TBI מתקדמת העלבון המכני העיקרי לתהליכי פציעה משניים, כולל אפופטוזיס ודלקת. מידול בעלי חיים היה בעל ערך בחיפוש כדי לפענח את מנגנוני הפציעה ולהעריך טיפולים נוירוהגנה פוטנציאליים. פרוטוקול זה מתאר את מודל ההשפעה הקורטיקלית הנשלטת (CCI) של מוקד, TBI בראש פתוח. במיוחד, הפרמטרים להפקת פציעה בקליפת הגוף קל מתונה מתוארים. השלכות התנהגותיות של CCI מנותח באמצעות מבחן ההסרה של סרט דביק של אינטגרציה דו sensorimotor. בנוגע לטיפול ניסיוני לפתולוגיה TBI, פרוטוקול זה ממחיש גם תהליך לזריעה של תאים מתורבתים במוח. תרביות תאים עצביים נגזר מתאי גזע המושרה על ידי האדם (hiPSCs) נבחרו עבור הפוטנציאל שלהם כדי להראות שיקום פונקציונלי מעולה בחולים TBI האדם. הישרדות כרונית של hiPSCs ברקמת המוח של העכבר המארח מזוהה באמצעות תהליך שונה של הליך אימונוהיסטוכימיה.
Introduction
פגיעה מוחית טראומטית (TBI) היא מונח כללי עבור הפגיעה הנרכשת במוח עקב כוחות מכניים עקיפים (האצה בסיבוב/האטה או קונטרה-הפיכה) ממכות לראש או נזק ישיר מחפצים או גלי הדף. Tbi הוערך להיות הגורם בערך 9% ממקרי המוות ברחבי העולם ונצפתה ב 50,000,000 במקרים מוערכים לשנה1,2. 2017 דיווח מהמרכזים לבקרת מחלות ומניעתן שנאמד ב-2013, היו סך של 2,800,000 ביקורים בבתי חולים ומקרי מוות עקב TBI בארצות הברית3. הרבה מאוד מתון. TBI רציני יכול להוביל לפגיעה לכל החיים של הכרה, תפקוד מוטורי, ואיכות העולם הכוללת. ההשלכות של tbi מתון, במיוחד הקשורות לספורט חוזרים tbi, היו רק לאחרונה העריכו את ההשפעות הבריאותיות חתרני שלהם4,5.
מידול קדם-קליני הוא מרכיב חיוני בפיתוח תובנות מכניסטיות חדשות וטיפול משחזרת פוטנציאלי עבור TBI. השפעת הקליפה הנשלטת (CCI) של TBI היא דגם של ראש פתוח של פציעה מכנית של חבלה בקליפת המוח. את פרמטרי ההשפעה ניתן לשנות כדי לייצר פציעות CCI כי נע בין קל עד חמור6. פציעות CCI הן מיקוד ולא מפוזר, כפי שנראה עם דגמי ראש סגורים אחרים של TBI. CCI ניתן לבצע כדי לגרום לפציעה חד צדדית, כך קליפת המוח יכול לשמש המשווה הפנימי. פרוטוקול זה ממחיש את המאפיינים של CCI מתון לחלק של קליפת המוח המקיף את האזורים הראשוניים והמנועים העיקריים. אזור קליפת הגוף הזה נבחר למעורבותו בהתנהגויות sensorimotor שבהן בדיקות התנהגות רבות יכולות לזהותאת החסרונות המושרה בפציעה. שיפורים התנהגותיים בשל התערבויות טיפוליות עבור TBI ניתן לזהות גם.
סימן ההיכר של TBI הוא התפקוד העצבי הנרחב באזור הנפגע. הנוירונים נפצעו עוברים מוות תאים, וקישוריות הרשת העצבית מופרת8,9. TBI משבש את הגיוס של תאי גזע אנדוגני, אשר מוביל התנהגות נוספת במורד הזרם של כדורי10,11. השתלת תאים גזע עצבי תאים גזע נגזר כבר נחקרו כאפשרות לשחזר את הפונקציה במוח הפצוע. בנוסף לפוטנציאל לשחזר המעגלים העצביים פגום, תאים מושתלים להפעיל אפקטים הפרצינית המעודדים הישרדות עצבית התאוששות פונקציונלית מ TBI12. מגוון סוגי תאים כבר מושתלים מראש כדי להעריך את הפוטנציאל המשחזרת שלהם במודלים של הפרעות נוירולוגיים13,14,15. הפופולריזציה האחרונות של טכנולוגיה תא גזע מושרה pluripotent16 יש הקלה על פיתוח של קווי גזע אנושי רבים לשימוש ניסיוני. בדיקות קדם-קליניות עם תאים שמקורם בהיסק היא צעד ראשון חשוב לאפיון יעילות טיפולית פוטנציאלית של קו התאים נגד מחלות אנושיות. מעבדה זו פיתחה פרוטוקולים להבדיל hiPSCs פנוטיפים עצביים17 במרדף אחר התאים שתילת שולחנות כדי לסייע התאוששות מפציעה טראומטית המוח.
ניסויים בפרוטוקול זה להשתמש CCI חד צדדית כדי לגרום TBI אל הסוחושי השמאלית ואת קליפת המנוע של עכברים מבוגרים. פציעה מתונה של CCI גורמת לגרעון תפקודי מתמשך, אשר משמש למעקב אחר ההשפעות של התא העצבי הנגזר של היפנוסק על התאוששות פונקציונלית. בדיקה מsensorimotor בפרוטוקול זה הותאמה ממתודולוגיה שהוקמה על ידי Bouet ועמיתיו18 והפגינו בעבר על ידי פלמינג ועמיתיו19. פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מלאה לביצוע פציעה מוחית ניסיונית, השתלת תרפיה של תאי ירכיים, ניתוח התנהגותי והיסטולוגית של צעדי התוצאה הניסיונית.
Protocol
Representative Results
Discussion
מתון CCI כמערכת מודל לבדיקת טיפול התחדשות ניסיוני
מודל CCI הוא כלי רב ערך לחקירת מנגנונים של חוסר תפקוד רקמות לאחר פגיעה מכנית בקליפת המוח. היכולת של פרמטרי הפציעה היא תכונה אטרקטיבית של דגם זה. לשנות את עומק Z של ההשפעה, את המהירות, או להתעכב זמן יכול להגדיל או להקטין את חומרת הפציע?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי מענק מהמרכז לרפואת מוח ומשובי (CNRM, גרנט מספר G170244014). אנו מעריכים את הסיוע של מאהלו Dewan ו קלרה Selbrede בלימודי פיילוט הסרת דבק. . וניתוחי השתלת תאים אמנדה פו ולורה טאקר של המעבדה הקדם-רפואית של CNRM מחקר הליבה סיפק ייעוץ יקר על ניתוחי בעלי חיים ובדיקות התנהגות, בהתאמה.
Materials
| 1 ml syringes | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
| 1.7 ml flip top test tubes | Denville | C2170 | |
| 10 microliter syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 25G Precision Glide syringe needles | Becton Dickinson (BD) | 305122 | |
| 70% ethanol | Product of choice; varies by region | ||
| acetaminophen oral suspension | Tylenol (Children's) | Dilute to 1 mg/ml in water | |
| anesthetic vaporizer | Vetland | 521-11-22 | |
| animal handling cloth | Purchase from department store | ||
| Betadine | Purdue Products | NDC-67618-151-32 | |
| compressed oxygen | Product of choice; varies by region | ||
| cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024-100mg | |
| DAB staining kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-500ml | |
| DMEM | Invitrogen (ThermoFisher) | A14430-01 | |
| donkey anti-mouse IgG antibody, HRP conjugated | Jackson ImmunoResearch | 715-035-151 | |
| electrical tape | 3M Corporation | Purchase from department store | |
| fine tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| glass capillary pipettes, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-3 | |
| High Speed Rotary Micromotor Kit | Foredom Electric Co. | K.1070 – K.107018 | |
| Ideal Micro Drill Burr Set Of 5 | Cell Point Scientific | 60-1000 | |
| Impact One Stereotaxic Impactor for CCI | Leica Biosystems | 39463920 | |
| isoflurane | Baxter | NDC-10019-360-60 | |
| lab bench timers | Fisher Scientific | 14-649-17 | |
| Micropipette puller | MicroData Instruments, Inc. | PMP-102 | Any puller will suffice |
| Microscope cover slips | Fisherbrand | 12-545-E | |
| Microscope slide mounting medium | Product of choice | ||
| mirror | Purchase from department store | ||
| mouse anti-human nuclear antigen antibody | Millipore | MAB1281 | |
| Mouse on Mouse blocking kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| needle holder hemostat | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| ophthalmic ointment | Falcon Pharmaceuticals | NDC-61314-631-36 | |
| ophthalmic spring scissors | Fine Science Tools | 15018-10 | |
| plastic box | Purchase from department store | ||
| plastic cylinder | Purchase from department store | ||
| QSI motorized syringe pump | Stoelting | 53311 | |
| Removable needle compression fitting | Hamilton | 55750-01 | |
| small rodent stereotaxic frame | Stoelting | 51925 | |
| small scissors | Fine Science Tools | 14060-09 | |
| StemPro Accutase | Invitrogen (ThermoFisher) | A1110501 | |
| Sterile alcohol prep pads | Fisherbrand | 06-669-62 | |
| sterile cotton swabs/Kendall Q-tips | Tyco Healthcare | 540500 | |
| Sterile saline | Hospira | NDC-0409-1966-07 | |
| Stopwatches (2) | Fisher Scientific | 06-662-56 | |
| Superfrost Plus Gold microscope slides | Fisherbrand | 15-188-48 | |
| sutures – 5.0 silk with curved needle | Oasis | MV-682 |
References
- Maas, A. I. R., et al. Traumatic brain injury: integrated approaches to improve prevention, clinical care, and research. The Lancet Neurology. 16, 987-1048 (2017).
- Murray, C. J., et al. Disability-adjusted life years (DALYs) for 291 diseases and injuries in 21 regions, 1990-2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. 380, 2197-2223 (2012).
- Taylor, C. A., Bell, J. M., Breiding, M. J., Xu, L. Traumatic Brain Injury-Related Emergency Department Visits, Hospitalizations, and Deaths – United States, 2007 and 2013. Morbidity and mortality weekly report: Surveillance summaries. 66, 1-16 (2017).
- Fehily, B., Fitzgerald, M. Repeated Mild Traumatic Brain Injury: Potential Mechanisms of Damage. Cell Transplantation. 26, 1131-1155 (2017).
- Kulbe, J. R., Hall, E. D. Chronic traumatic encephalopathy-integration of canonical traumatic brain injury secondary injury mechanisms with tau pathology. Progress in Neurobiology. 158, 15-44 (2017).
- Romine, J., Gao, X., Chen, J. Controlled cortical impact model for traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. , e51781 (2014).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Mishra, A. M., et al. Decreased resting functional connectivity after traumatic brain injury in the rat. PloS ONE. 9, 95280 (2014).
- Sours, C., et al. Default mode network interference in mild traumatic brain injury – a pilot resting state study. Brain Research. 1537, 201-215 (2013).
- Radomski, K. L., Zhou, Q., Yi, K. J., Doughty, M. L. Cortical contusion injury disrupts olfactory bulb neurogenesis in adult mice. BMC Neuroscience. 14, 142 (2013).
- Wang, X., Gao, X., Michalski, S., Zhao, S., Chen, J. Traumatic Brain Injury Severity Affects Neurogenesis in Adult Mouse Hippocampus. Journal of Neurotrauma. 33, 721-733 (2016).
- Aertker, B. M., Bedi, S., Cox, C. S. Strategies for CNS repair following TBI. Experimental Neurology. 275 (3), 411-426 (2016).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548, 592-596 (2017).
- Kondo, T., et al. Focal transplantation of human iPSC-derived glial-rich neural progenitors improves lifespan of ALS mice. Stem Cell Reports. 3, 242-249 (2014).
- Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34, 9506-9515 (2014).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Lischka, F. W., et al. Neonatal mouse cortical but not isogenic human astrocyte feeder layers enhance the functional maturation of induced pluripotent stem cell-derived neurons in culture. Glia. 66, 725-748 (2018).
- Bouet, V., et al. The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice. Nature Protocols. 4, 1560-1564 (2009).
- Fleming, S. M., Ekhator, O. R., Ghisays, V. Assessment of sensorimotor function in mouse models of Parkinson’s disease. Journal of Visualized Experiments. , e50303 (2013).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 2nd edn. , (2004).
- Jacobs, G. H., Williams, G. A., Cahill, H., Nathans, J. Emergence of novel color vision in mice engineered to express a human cone photopigment. Science. 315, 1723-1725 (2007).
- Lundell, T. G., Zhou, Q., Doughty, M. L. Neurogenin1 expression in cell lineages of the cerebellar cortex in embryonic and postnatal mice. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 238, 3310-3325 (2009).
- Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. More hippocampal neurons in adult mice living in an enriched environment. Nature. 386, 493-495 (1997).
- Piltti, K. M., et al. Transplantation dose alters the dynamics of human neural stem cell engraftment, proliferation and migration after spinal cord injury. Stem Cell Research. 15, 341-353 (2015).
- Yu, S., et al. Severity of controlled cortical impact traumatic brain injury in rats and mice dictates degree of behavioral deficits. Brain Research. 1287, 157-163 (2009).
- Kabadi, S. V., Hilton, G. D., Stoica, B. A., Zapple, D. N., Faden, A. I. Fluid-percussion-induced traumatic brain injury model in rats. Nature Protocols. 5, 1552-1563 (2010).
- Namjoshi, D. R., et al. Defining the biomechanical and biological threshold of murine mild traumatic brain injury using CHIMERA (Closed Head Impact Model of Engineered Rotational Acceleration). Experimental Neurology. 292, 80-91 (2017).
- Shetty, A. K., Mishra, V., Kodali, M., Hattiangady, B. Blood brain barrier dysfunction and delayed neurological deficits in mild traumatic brain injury induced by blast shock waves. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 232 (2014).
- Petraglia, A. L., Dashnaw, M. L., Turner, R. C., Bailes, J. E. Models of mild traumatic brain injury: translation of physiological and anatomic injury. Neurosurgery. 75, 34-49 (2014).
- Siebold, L., Obenaus, A., Goyal, R. Criteria to define mild, moderate, and severe traumatic brain injury in the mouse controlled cortical impact model. Experimental Neurology. 310, 48-57 (2018).
- Tucker, L. B., Fu, A. H., McCabe, J. T. Performance of Male and Female C57BL/6J Mice on Motor and Cognitive Tasks Commonly Used in Pre-Clinical Traumatic Brain Injury Research. Journal of Neurotrauma. 33, 880-894 (2016).
- Rose, S. C., Fischer, A. N., Heyer, G. L. How long is too long? The lack of consensus regarding the post-concussion syndrome diagnosis. Brain Injury. 29, 798-803 (2015).
- Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7, 825-826 (2010).
- Li, X., et al. Chronic behavioral testing after focal ischemia in the mouse: functional recovery and the effects of gender. Experimental Neurology. 187, 94-104 (2004).
- Andersen, A. B., Finger, S., Andersen, C. S., Hoagland, N. Sensorimotor cortical lesion effects and treatment with nimodipine. Physiology & Behavior. 47, 1045-1052 (1990).
- Al-Ali, H., et al. The mTOR Substrate S6 Kinase 1 (S6K1) Is a Negative Regulator of Axon Regeneration and a Potential Drug Target for Central Nervous System Injury. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37, 7079-7095 (2017).
- Pleasant, J. M., et al. Rate of neurodegeneration in the mouse controlled cortical impact model is influenced by impactor tip shape: implications for mechanistic and therapeutic studies. Journal of Neurotrauma. 28, 2245-2262 (2011).
