Summary

Opsonophagocytic 살해 분석 결과 세균성 병원 체에 대 한 면역학 응답을 평가 하

Published: April 05, 2019
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Summary

이 opsonophagocytic 죽이 분석 결과 응답 하 고 다른 치료 조건에 기반 하는 박테리아를 죽 일 phagocytic 면역 세포의 기능을 비교 하는 데 사용 됩니다. 고아 하 게,이 분석 결과 opsonin로 박테리아에 대하여 제기 하는 항 체의 효과 기 기능을 평가 하기 위한 황금 표준 역할을 합니다.

Abstract

호스트의 세균성 식민지에 면역 반응의 중요 한 부분은 이다 식 균 작용. Opsonophagocytic 살해 분석 결과 (OPKA) phagocytic 세포는 세균 대 공동 교양 있는 실험적인 절차 이다.입니다. 면역 세포 phagocytose 하 고 보완 종속 방식에서 세균성 문화를 죽 일 것 이다. 중재 하는 면역 세포 살해의 여러 가지 요인에 따라 달라 집니다 효율과 어떻게 다른 박테리아를 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다 세포 죽음에 관하여 문화 비교. 이 방법에서는, 특정 세균성 긴장 또는 serotypes에 대 한 잠재적인 면역 기반 치료제의 효능을 평가 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 기본적인 문화 조건 및 셀 세 치료 조건 및 HL-60 면역 세포 공동 문화 후 세균 세포 생존 능력을 결정 하는 단순화 된 OPKA를 설명 합니다. 이 메서드는 다른 폐 렴 serotypes, capsular와 acapsular 긴장, 및 다른 세균 종 수와 성공적으로 이용 되어. 이 OPKA 프로토콜의 이점은 그것의 간명, 다양성 (로이 분석 결과 opsonins로 항 체 치료에 국한 되지 않습니다), 그리고 시간과 기본 실험 그룹을 평가 하기 위해 시 약의 최소화.

Introduction

Opsonophagocytic 분석 결과 (OPKA)를 죽이 세균성 구조 또는 기능 변경 이후의 변화 면역 반응 및 기능에 연결 하기 위한 중요 한 도구입니다. 이와 같이, 그것 자주 면역 기반 항 체 치료, 백신 후보자, 효소 최적화 등의 효능을 결정 하기 위해 분석 결과 보완으로 사용 됩니다. Vivo에서 분석 실험 공간이 세균 감염 모델에 보호를 결정 하는 데 필요한 반면는 OPKA 평가 세균성 세포 죽음에 면역 기여 가장 기본적인 구성 요소를 사용할 수 있습니다: 박테리아, 면역 세포, 및 실험 치료입니다. 이전 연구는 OPKAs 수정 하 고 다양 한 박테리아와 serotypes, 연쇄 상 구 균 균1,2 포도 상 구 균, 녹 농 균3를 포함 하 여 사용할 수 있습니다 나타났습니다. 또한, 이러한 최적화 된 분석 실험 박테리아를 더 개선 보완-중재 면역 세포4 및 항 체 치료에 액세스할 수 있도록 하는 효소의 기능을 포함 하 여 다른 실험적 치료를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. opsonization5. 고전적인, OPKA 분석 결과 성공적으로 사용 되었다 기초 및 임상 연구에서 병원 체 특정 항 체6,,78,9에 의해 유도 된 보호에 대 한 강력한 표시기로 설정 .

Opsonophagocytic 살해의 평가 대 한 면역 세포의 다른 종류를 사용할 수 있습니다. 1 일반적으로 사용 되 phagocytic 인구는 HL-60 인간 leukemic 세포 라인. 이 셀 라인 배양에서 사 promyelocytes로 유지 될 수 있다 그러나, 그들은 다른 약물 치료10,11을 통해 다양 한 활성화 상태에 분화 될 수 있다. HL60 n의 처리, N dimethylformamide 강한 phagocytic 활동11활성화 된 호 중구에 셀 라인을 차별화합니다. HL-60 셀 최적화 되어10이 먹어서 분석 실험 위해 자주 사용 하는 동안 다른 기본 polymorphonuclear 백혈구 면역 실험12팔으로 사용할 수 있습니다.

또한, 이러한 분석 실험 또는 단순화 된13 수 다중화14 테스트할 박테리아의 여러 항생제 내성 변종에 보고. 멀티플렉스 메서드는 더 효율적으로 한 접시15자리 당 단위 (CFUs)를 형성 하는 세균성 식민지를 셀 수 있는 소프트웨어의 개발을 통해 실현 하였습니다. 여기, 하나의 세균, HL-60 셀, 아기 토끼 보완, 긴장과 혈액 한 천 배지를 사용 하 여 효율적인된 방안을 설명 합니다. 이 방법으로 여러 치료 세균성 감염에 타고 난 면역 반응 수 변조 하는 방법에 대 한 특정 연구 질문을 해결 하기 위해 신속 하 게 평가 될 수 있다.

Protocol

1. 문화, 차별화, 및 HL-60 셀의 유효성 검사 500 mL와 L-글루타민 및 50 mL 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 RPMI의 HL-60 세포 배양을 준비 합니다. HL-60 세포의 분화에 영향을 미칠 수 있습니다이 항생제를 추가 하지 마십시오. 전파/HL-60 세포의 유지 보수에 대 한 문화 5 x 106 셀 75 cm2 HL-60 세포 배양의 10 mL에 37 ° C, 5% CO2플라스 크 통풍. 최적의 세포 농도 유지 하?…

Representative Results

HL-60 차별화의 유효성 검사는 OPKA를 시작 하기 전에 수행 되어야 합니다. 이 CD11b, CD35, CD71, 및 annexin V (그림 1)의 세포 외 식을 결정 하려면 cytometry 사용 하 여 수행할 수 있습니다. Propidium 요오드 화물은 또한 생존의 표식으로 사용할 수 있습니다. 치료를 받고 이후 DMF와 3 일, CD35의 식을 증가 한다 (모든 셀의 ≥55%) CD71의 표현을 감소 한다 (모든 셀의 ≤20%). Annexin V +와 함께 propi…

Discussion

OPKAs 예방 접종6,8에 의해 유도 된 항 체 중재 면역 반응 평가에 필수적인 역할을 제공 합니다. 이 단순화 된 OPKA의 주요 중요성은 테스트할 조건에 (즉, 항 체, 효소 치료, 등.). 이런이 의미에서이 분석 결과에 먹어서, opsonins (즉, 항 체)의 기여를 테스트를 사용할 수 있는 동안 그것은 또한 사용할 수 있습니다 일반적으로 phagocytic 경로 억제 하는 독성 요소…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 우리의 실험실에서 OPKA 분석 실험에서 그의 귀중 한 원조에 대 한 박사 문 남 (알라바 마의 대학 버밍엄) 감사 합니다. 이 작품은 국가 학회 건강 그랜트 1R01AI123383-01A1 FYA에 의해 지원 되었다.

Materials

Annexin V (APC conjugated) BioLegend 640919
anti-CD35, human (PE conjugated) BioLegend 333405
anti-CD71, human (PE conjugated) BioLegend 334105
bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2) Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) 
blood agar plates Hardy Diagnostic A10
Fetal Clone serum HyClone SH30080.03
glycerol Sigma G9012-1L
HL-60 cells ATCC CCL-240
IgG Isotype Control (PE conjugated) BioLegend 400907
N,N-dimethylformamide (DMF) Fisher Chemical UN2265
propidium iodide Sigma P4864
RPMI media with L-glutamine Corning 10-040-CV

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Cite This Article
Paschall, A. V., Middleton, D. R., Avci, F. Y. Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. (146), e59400, doi:10.3791/59400 (2019).

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