Opsonophagocytic убийства Assay оценить иммунологические реакции против бактериальных патогенов
Summary
Этот assay убийство opsonophagocytic используется для сравнения способность фагоцитирующих иммунных клеток реагировать и убивают бактерии, основанные на различных методов лечения и/или условий. Классически этот assay служит золотой стандарт для оценки эффекторные функции антител против бактерий как опсонин.
Abstract
Ключевым аспектом иммунного ответа на бактериальной колонизации хоста является фагоцитоза. Assay убийство opsonophagocytic (OPKA) является экспериментальной процедуры, в котором фагоцитирующих клеток совместно культивируемых с бактериальной единиц. Иммунные клетки фагоцитоз и убить бактериальных культур в духе дополнение зависимых. Эффективность убийства клеток иммунной системы зависит от целого ряда факторов и может использоваться для определения различных бактериальных культур сравнения в отношении устойчивости к смерти клетки. Таким образом можно оценить эффективность потенциал на основе иммунной терапии против конкретных штаммов бактерий и/или серотипов. В этом протоколе мы описываем упрощенная OPKA, которая использует основные культуры условий и клеток подсчета для определения жизнеспособности бактериальных клеток после совместного культуры с условий лечения и иммунных клеток HL-60. Этот метод был успешно использован с рядом различных серотипов пневмококков, капсульные и acapsular штаммов и других бактериальных видов. Преимущества этого протокола OPKA являются его простота, универсальность (как этот assay не ограничивается лечения антителами как опсонины) и минимизации времени и реагенты для оценки основных экспериментальных групп.
Introduction
Opsonophagocytic убийства пробирного (OPKA) является важнейшим инструментом для увязки изменения в бактериальных структуры или функции для последующих изменений в иммунной реакции и функции. Таким образом он часто используется в качестве дополнительного анализа для определения на основе иммунной эффективность лечения антителами, вакцин-кандидатов, оптимизация фермента и т.д. Хотя в естественных условиях анализы необходимы для определения эффективного разминирования или защиты в модели бактериальной инфекции, OPKA может использоваться для оценки иммунного вклад в бактериальной клетке смерти на самых основных компонентов: бактерии, иммунные клетки и экспериментальные лечение. Предыдущие исследования показали, что OPKAs могут быть модифицировать и использовать для различных бактерий и серотипов, включая Streptococcus pneumoniae1,2 золотистый стафилококк, синегнойная3. Кроме того эти оптимизированные анализов может использоваться для оценки различных экспериментальных процедур, включая фермента возможность сделать более доступными для дополнения опосредованных иммунных клеток4 и антитела лечение для улучшения бактерии опсонизацию5. Классически, OPKA пробирного успешно используется в фундаментальных и клинических исследованиях параметры как мощный индикатор для защиты индуцированных возбудителя специфические антитела6,,78,9 .
Различные типы иммунных клеток может использоваться для оценки opsonophagocytic убийства. Один из часто используемых фагоцитарной населения является линия человека лейкозных клеток HL-60. Эта линия клетки могут храниться как инактивированных promyelocytes в культуре; Однако они могут быть продифференцированы в различных активированных государства через различных наркотиков лечения10,11. Лечение HL60 с N, N-Диметилформамид дифференцирует линии клетки в активированных нейтрофилов с сильным фагоцитарной активности11. В то время как клеток HL-60 были оптимизированы и часто используются для этих анализов фагоцитоза10, других первичных полиморфноядерных лейкоцитов может использоваться как иммунные руку эксперимент12.
Кроме того эти анализы может быть упрощенной13 или мультиплексированных14 взглянуть на несколько устойчивых к антибиотикам штаммов бактерий для проверки. Мультиплексированных метод был достигнут более реальным путем разработки программного обеспечения, которое может эффективно рассчитывать бактериальные колонии, образуя единиц (CFUs) за пятно на плиты агара15. Здесь мы описываем рациональный метод, используя один штамм бактерий, клеток HL-60, ребенок кролика дополнением и плиты агара крови. С помощью этого метода несколько процедур можно быстро оценить вопросы конкретных исследований на как можно модулировать врожденный иммунный ответ к бактериальной инфекции.
Protocol
Representative Results
Discussion
OPKAs служат существенно важную роль в оценке антител при посредничестве иммунных реакций, вызванных прививки6,8. Основной смысл этой упрощенной OPKA является адаптируемость в условиях для проверки (то есть, антитела, фермента лечения и т.д.). В этом смысле в то…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р Муна Nahm (Университет штата Алабама Бирмингем) за его неоценимую помощь в создании OPKA анализы в нашей лаборатории. Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грант 1R01AI123383-01A1 для FYA.
Materials
| Annexin V (APC conjugated) | BioLegend | 640919 | |
| anti-CD35, human (PE conjugated) | BioLegend | 333405 | |
| anti-CD71, human (PE conjugated) | BioLegend | 334105 | |
| bacterial strain to be used (ie, Streptococcus pneumoniae, WU2) | Bacterial Respiratory Reference Laboratory (Dr. Moon Nahm) | ||
| blood agar plates | Hardy Diagnostic | A10 | |
| Fetal Clone serum | HyClone | SH30080.03 | |
| glycerol | Sigma | G9012-1L | |
| HL-60 cells | ATCC | CCL-240 | |
| IgG Isotype Control (PE conjugated) | BioLegend | 400907 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Fisher Chemical | UN2265 | |
| propidium iodide | Sigma | P4864 | |
| RPMI media with L-glutamine | Corning | 10-040-CV |
References
- Romero-Steiner, S., et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).
- Nanra, J. S., et al. Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus. Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).
- Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin. Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).
- Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense. Infection and Immunity. , (2018).
- Baker, C. J., Noya, F. J. Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection. Reviews of Infectious Diseases. 12, 476-482 (1990).
- Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice. Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).
- Parameswarappa, S. G., et al. A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection. Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).
- Jackson, L., et al. Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).
- Cywes-Bentley, C., et al. Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).
- Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).
- Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).
- Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).
- Dwyer, M., Gadjeva, M. Opsonophagocytic assay. Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).
- Burton, R. L., Nahm, M. H. Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20. Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).
- Clarke, M. L., et al. Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies. Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).
- Aanei, C. M., et al. Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation. Journal of Visualized Experiments. (141), e57867 (2018).
- Hirz, T., Dumontet, C. Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents. Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846 (2016).
- Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death. Journal of Visualized Experiments. (50), 2597 (2011).
- Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry. Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).
- Middleton, D. R., et al. Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352. Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).
