Automatisierte 3D-Optische Kohärenztomographie zur Aufklärung der Biofilmmorphogenese über große räumliche Skalen
Summary
Mikrobielle Biofilme bilden komplexe Architekturen an Interphasen und entwickeln sich zu stark maßstabsabhängigen Raummustern. Hier stellen wir ein experimentelles System (Hard- und Software) zur automatisierten Erfassung von 3D-Datensätzen zur optischen Kohärenztomographie (OCT) vor. Dieses Toolset ermöglicht die nichtinvasive und multiskalige Charakterisierung der Biofilmmorphogenese in Raum und Zeit.
Abstract
Biofilme sind ein sehr erfolgreicher mikrobieller Lebensstil und setzen sich in einer Vielzahl von Umwelt- und Ingenieurumgebungen durch. Das Verständnis der Biofilmmorphogenese, d. h. der strukturellen Diversifikation von Biofilmen während der Gemeinschaftsversammlung, stellt eine bemerkenswerte Herausforderung über räumliche und zeitliche Skalen hinweg dar. Hier präsentieren wir ein automatisiertes Biofilm-Bildgebungssystem auf Basis der optischen Kohärenztomographie (OCT). OCT ist eine neue bildgebende Technik in der Biofilmforschung. Die Datenmenge, die derzeit erfasst und verarbeitet werden kann, behindert jedoch die statistische Schlussfolgerung großer Muster in der Biofilmmorphologie. Das automatisierte OCT-Bildgebungssystem ermöglicht die Abdeckung großer räumlicher und erweiterter zeitlicher Skalen des Biofilmwachstums. Es kombiniert ein kommerziell erhältliches OCT-System mit einer Robotik-Positionierungsplattform und einer Reihe von Softwarelösungen zur Steuerung der Positionierung der OCT-Scansonde sowie zur Erfassung und Verarbeitung von 3D-Biofilm-Imaging-Datensätzen. Dieses Setup ermöglicht die in-situ und nicht-invasive automatisierte Überwachung der Biofilmentwicklung und kann weiterentwickelt werden, um DIE OCT-Bildgebung mit Makrofotografie und Mikrosensorprofilierung zu koppeln.
Introduction
Biofilme sind eine sehr erfolgreiche mikrobielle Lebensstilanpassung und diese interphasenassoziierten und matrixumschlossenen Gemeinschaften von Mikroorganismen dominieren das mikrobielle Leben in natürlichen und industriellen Umgebungen1,2. Dort bilden Biofilme komplexe Architekturen, wie längliche Streamer3, Ripples4 oder pilzartige Kappen5 mit wichtigen Folgen für Biofilmwachstum, strukturelle Stabilität und Stressresistenz6. Während viel über die strukturelle Differenzierung von Biofilmen aus der Arbeit an Mono-Arten-Kulturen gelernt wurde, die in Miniatur-Flusskammern angebaut werden, sind die meisten Biofilme hochkomplexe Gemeinschaften, die oft Mitglieder aller Lebensbereiche umfassen6. Diese komplexen Biofilme als mikrobielle Landschaften zu würdigen7 und zu verstehen, wie Biofilmstruktur und -funktion in komplexen Gemeinschaften interagieren, steht damit an vorderster Front der Biofilmforschung.
Ein mechanistisches Verständnis der Morphogenese komplexer Biofilme als Reaktion auf Umwelthinweise erfordert sorgfältig konzipierte Experimente in Verbindung mit räumlich und zeitlich aufgelösten Beobachtungen der physikalischen Struktur des Biofilms über relevante Skalen8. Die zerstörungsfreie Beobachtung des Biofilmwachstums in experimentellen Systemen wurde jedoch durch logistische Zwänge wie die Notwendigkeit, Proben (z. B. in ein Mikroskop) zu verschieben, die häufig die empfindliche Biofilmstruktur schädigen, stark eingeschränkt.
Das hier vorgestellte Protokoll führt ein vollautomatisiertes System auf der Grundlage der optischen Kohärenztomographie (OCT) ein, das die in situ, nicht-invasive Überwachung der Biofilmmorphogenese im Mesoscale (mm-Bereich) ermöglicht. OCT ist eine neue bildgebende Technik in der Biofilmforschung mit Anwendungen in der Wasseraufbereitung und Biofouling-Forschung, Medizin9 und Strömungsökologie10. In OCT wird eine lichtarme Lichtquelle in einen Proben- und Referenzarm aufgeteilt; die Interferenz des vom Biofilm reflektierten und gestreuten Lichts (Probenarm) und das Licht des Referenzarms wird analysiert. Eine Reihe von axialen Intensitätsprofilen (A-Scans), die tief aufgelöste Strukturinformationen enthält, wird erfasst und zu einem B-Scan (einem Querschnitt) zusammengeführt. Eine Reihe benachbarter B-Scans bildet den endgültigen 3D-Volume-Scan10. OCT bietet eine seitliche optische Auflösung im Bereich von ca. 10 m und eignet sich daher gut zur Untersuchung der meskopischen strukturellen Differenzierung von Biofilmen10,12. Eine ausführlichere Beschreibung des ÜLG finden Sie unter Drexler und Fujimoto13und Fercher und Kollegen14. Obwohl das Sichtfeld eines einzelnen OCT-Xy-Scans bis zu Hunderte von Quadratischen Mikrometern erreicht, können größere Muster nicht mit Hilfe von OCT in einem einzigen Scan quantifiziert werden. In Bezug auf Biofilme in natürlichen Lebensräumen wie Bächen und Flüssen schränkt dies derzeit unsere Fähigkeit ein, die Biofilmmorphogenese in Schuppen zu bewerten, die der physikalischen und hydraulischen Vorlage des Lebensraums entsprechen.
Um diese räumlichen Grenzen zu überschreiten und OCT-Scans automatisch zu erfassen, wurde eine Spektral-Domain-OCT-Bildsonde auf einem 3-Achsen-Positionierungssystem montiert. Die Installation ermöglicht die Erfassung mehrerer OCT-Scans in einem überlappenden Mosaikmuster (Kachelscan), wodurch die tomographische Abbildung von Oberflächen bis 100 cm2effektiv erreicht wird. Darüber hinaus ermöglicht die hohe Positionierpräzision dieses Systems eine zuverlässige Überwachung des Wachstums und der Entwicklung von Biofilmmerkmalen an bestimmten Standorten bei Langzeitexperimenten. Das System ist modular aufgebaut und einzelne Komponenten (z.B. Positioniergerät und OCT) der Anlage können als Standalone-Lösungen eingesetzt oder flexibel kombiniert werden. Abbildung 1 gibt einen Überblick über die Hard- und Softwarekomponenten der Installation.
Das System wurde mit einer handelsüblichen GRBL-gesteuerten CNC-Positioniervorrichtung (Materialtabelle )getestet. Die Betriebsabstände dieser speziellen Positionierplattform betragen 600 x 840 x 140 mm, mit einer herstellergenauen Genauigkeit von +/- 0,05 mm und einer programmierbaren Auflösung von 0,005 mm. GRBL ist eine Open-Source-(GPLv3-Lizenz), eine leistungsstarke Bewegungssteuerung für CNC Geräte. Daher sollte jedes GRBL-basierte (Version > 1.1) Positionierungsgerät mit den hier vorgestellten Richtlinien und Softwarepaketen kompatibel sein. Darüber hinaus konnte die Software mit wenigen Modifikationen an andere Schrittmotorregler mit STEP-DIR-Eingangstyp angepasst werden.
Das OCT-Gerät zur Beurteilung der Leistung des Systems (Tabelle der Materialien) verfügt über eine lichtarme Lichtquelle mit einer mittleren Wellenlänge von 930 nm (Bandbreite = 160 nm) und einstellbarer Referenzarmlänge und -intensität. Im hier vorgestellten Beispiel wurde auch ein Tauchadapter zum Eintauchen der OCT-Sonde in fließendes Wasser verwendet (Tabelle der Materialien). Das hier für die automatisierte OCT-Scanerfassung entwickelte Softwarepaket hängt entscheidend vom SDK zusammen mit dem spezifischen OCT-System ab, jedoch sollten OCT-Systeme desselben Herstellers mit unterschiedlichen Scanlinsen und zentralen Wellenlängen leicht kompatibel.
Das GRBL-Gerät wird von einem Webserver gesteuert, der auf einem Einplatinencomputer installiert ist (Abbildung 1). Dadurch wird die Fernsteuerung des Geräts von jedem Computer mit lokalem Netzwerk oder Internetzugang gewährt. Das OCT-Gerät wird von einem separaten Computer gesteuert, so dass der Betrieb des OCT-Systems neben dem automatisierten Versuchsaufbau möglich ist. Schließlich enthalten die Softwarepakete Bibliotheken zum Synchronisieren der OCT-Sondenpositionierung und der OCT-Scanerfassung (d. h. zum automatischen Erfassen von 3D-Bilddatensätzen in einem Mosaikmuster oder in einer Reihe definierterPositionen). Die Definition der Position der OCT-Sonde in 3D ermöglicht effektiv die Einstellung der Brennebene speziell für (regionale) Scans. Insbesondere können auf unebenen Flächen für jeden OCT-Scan unterschiedliche Brennebenen (d.h. unterschiedliche Positionen in z-Richtung) angegeben werden.
Eine Reihe von Softwarepaketen wurde entwickelt, um rohe OCT-Scans zu verarbeiten (Tabelle 1). Die Navigation des Positioniergeräts, die OCT-Scanerfassung und die Datensatzverarbeitung werden mit Python-codierten Jupyter-Notebooks durchgeführt, die eine bemerkenswerte Flexibilität bei der Entwicklung und Optimierung der Software ermöglichen. Zwei bearbeitete und mit Anmerkungen bezeichnete Beispiele solcher Notizbücher (für die Bildaufnahme bzw. -verarbeitung) sind ab https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git Sie sind als Ausgangspunkte für die Anpassung gedacht. der Methode. Ein Jupyter-Notebook ist eine Webbrowser-basierte Anwendung, die Zellen mit mit Anmerkungen python-Code enthält. Jeder Schritt ist in einer Zelle des Notizbuchs enthalten, die separat ausgeführt werden kann. Aufgrund der unterschiedlichen Länge des Lichtpfades durch die Scanlinse (sphärische Aberration)15erscheinen die rohen OCT-Scans verzerrt (Abbildung 2A). Wir haben einen Algorithmus entwickelt, um diese Verzerrung in erfassten OCT-Scans automatisch zu korrigieren (enthalten in ImageProcessing.ipynb, Supplementary File 1). Darüber hinaus kann die Biofilmmorphologie als 2D-Höhenkarte visualisiert werden, wie sie zuvor in Membransystemen16verwendet wurde, und wir veranschaulichen, wie Höhenkarten aus Scans, die in einem Kachelarray aufgenommen wurden, genäht werden können.
Schließlich wird die Funktionalität der beschriebenen Laborinstallation anhand eines Flume-Experiments veranschaulicht, bei dem phototropher Strombiofilm einem Gradienten der Strömungsgeschwindigkeit ausgesetzt ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die OCT-Bildgebung eignet sich gut, um Strukturen im Mikrometerbereich mit einem FOV von mehreren Quadratmillimetern aufzulösen. Es ist somit ein leistungsfähiges Werkzeug für die Biofilmforschung10,18. Allerdings ist OCT derzeit auf eine maximale Scanfläche von 100 – 256 mm2beschränkt, während Biofilmstrukturmuster diese räumliche Skala oft übersteigen19, insbesondere wenn die morphologische Differenzierung durch große…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Mauricio Aguirre Morales für seinen Beitrag zur Entwicklung dieses Systems. Finanzielle Unterstützung kam vom Schweizerischen Nationalfonds an T.J.B.
Materials
| OCT Probe | Thorlabs | GAN210C1 | OCT imaging device |
| OCT scan lens | Thorlabs | OCT-LK3-BB | |
| Immersion adapter | Thorlabs | OCT-IMM3-SP1 | |
| Stepcraft 840 CK | STEPCRAFT | NA | positioning device |
| microcontroller | Arduino Uno R3 | NA | |
| Single-board computer | Raspberry PI | NA | |
| camera | Canon EOS 7D Mark II | NA | |
| camera lens | Canon MACRO EFS 35 mm | NA |
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