Tomografia a coerenza ottica 3D automatizzata per chiarire la morfogenesi del biofilm su grandi scale spaziali

I biofilm sono un adattamento di stile di vita microbico di grande successo e queste comunità di microrganismi associate a matrici associate a matrici e associate a matrici dominano la vita microbica in ambienti naturali e industriali^1,2. Lì, i biofilm formano architetture complesse, comegli streamer allungati 3, le increspature⁴ o i tappi simili a funghi⁵ con importanti conseguenze per la crescita del biofilm, la stabilità strutturale e la resistenza allo stress⁶. Mentre molto sulla differenziazione strutturale dei biofilm è stata appresa dal lavoro sulle culture monospecie coltivate in camere di flusso in miniatura, la maggior parte dei biofilm sono comunità altamente complesse, spesso compresi i membri di tutti i domini della vita⁶. Apprezzare questi complessi biofilm come paesaggi microbici⁷ e comprendere come la struttura e la funzione dei biofilm interagiscono in comunità complesse è quindi in prima linea nella ricerca sui biofilm.

Una comprensione meccanicistica della morfogenesi di biofilm complessi in risposta a segnali ambientali richiede esperimenti attentamente progettati in combinazione con osservazioni spaziali e temporali della struttura fisica dei biofilm attraverso bilance⁸. Tuttavia, l’osservazione non distruttiva della crescita di biofilm nei sistemi sperimentali è stata fortemente limitata da vincoli logistici come la necessità di spostare campioni (ad esempio, al microscopio) spesso danneggiando la delicata struttura del biofilm.

Il protocollo qui presentato introduce un sistema completamente automatizzato basato sulla tomografia a coerenza ottica (OCT), che consente il monitoraggio in situ e non invasivo della morfogenesi dei biofilm su scala mesoscala (gamma mm). L’OCT è una tecnica di imaging emergente nella ricerca sui biofilm con applicazioni nel trattamento delle acque e nella ricerca sul biofouling, medicina⁹ ed ecologia del flusso¹⁰. Nella PTOM, una sorgente di luce a bassa coerenza viene divisa in un campione e in un braccio di riferimento; viene analizzata l’interferenza della luce riflessa e dispersa dal biofilm (braccio campione) e la luce del braccio di riferimento. Una serie di profili di intensità assiale (A-scan) che contiene informazioni strutturali risolte in profondità viene acquisita e unita in un B-scan (una sezione trasversale). Una serie di B-scan adiacenti compone la scansione del volume 3D finale¹⁰. Il PToM fornisce una risoluzione ottica laterale nell’intervallo di circa 10 m ed è quindi adatto per studiare la differenziazione strutturale mesoscopica dei biofilm^10,12. Per una descrizione più dettagliata dello Strumento di personalizzazione di Office, fare riferimento a Drexler e Fujimoto¹³e Fercher e colleghi¹⁴. Sebbene il campo visivo di una singola analisi xy dello Strumento di personalizzazione di Office raggiunga fino a centinaia di micrometri quadrati, i modelli su scala più grande non possono essere quantificati mediante lo Strumento di personalizzazione di Office in una singola analisi. Per quanto riguarda i biofilm in habitat naturali come corsi d’acqua e fiumi, questo attualmente limita la nostra capacità di valutare la morfogenesi del biofilm su scale corrispondenti al modello fisico e idraulico dell’habitat.

Per superare questi limiti spaziali e acquisire automaticamente le scansioni dello Strumento di personalizzazione di Office, è stata montata una sonda di imaging dello OCT basata su un dominio spettrale su un sistema di posizionamento a 3 assi. L’installazione consente l’acquisizione di diverse scansioni OCT in un mosaico sovrapposto (taccature), ottenendo in modo efficace l’imaging tomografico di aree di superficie fino a 100 cm². Inoltre, l’elevata precisione di posizionamento di questo sistema consente di monitorare in modo affidabile la crescita e lo sviluppo delle caratteristiche dei biofilm in siti specifici durante esperimenti a lungo termine. Il sistema è modulare e singoli componenti (ad esempio, dispositivo di posizionamento e OCT) dell’installazione possono essere utilizzati come soluzioni autonome o combinati in modo flessibile. Figura 1 fornisce una panoramica dei componenti hardware e hardware dell’installazione.

Il sistema è stato testato con un dispositivo di posizionamento CNC a supporto GRBL disponibile in commercio (Table of Materials). Le distanze di funzionamento di questa specifica piattaforma di posizionamento sono di 600-840-140 mm, con una precisione indicata dal produttore di 0,05 mm e una risoluzione programmabile di 0,005 mm. GRBL è un open-source (licenza GPLv3), un controllo del movimento ad alte prestazioni per CNC Dispositivi. Pertanto, ogni dispositivo di posizionamento basato su GRBL (versione > 1.1) deve essere compatibile con le linee guida e i pacchetti software qui presentati. Inoltre, il software potrebbe essere adattato ad altri controller stepmotor con tipo di ingresso STEP-DIR con poche modifiche.

Il dispositivo dello Strumento di personalizzazione di Office utilizzato per valutare le prestazioni del sistema (Tabella dei materiali) presenta una sorgente luminosa a bassa coerenza con una lunghezza d’onda centrale di 930 nm (larghezza di banda : 160 nm) e lunghezza e intensità del braccio di riferimento regolabili. Nell’esempio qui presentato è stato utilizzato anche un adattatore per l’immersione della sonda dello Strumento di personalizzazione di Office (Tabella dei materiali). Il pacchetto software sviluppato qui per l’acquisizione automatica dell’analisi dello Strumento di personalizzazione di Office dipende in modo critico dall’SDK fornito insieme al sistema dello Strumento di personalizzazione di Office specifico, tuttavia, i sistemi dello Strumento di personalizzazione di Office dello stesso produttore con lenti di scansione e lunghezze d’onda centrali diverse dovrebbero essere prontamente compatibile.

Il dispositivo GRBL è controllato da un server Web installato su un computer a scheda singola (Figura 1). Ciò garantisce il controllo remoto del dispositivo da qualsiasi computer con accesso a Internet o rete locale. Il dispositivo DELLO Strumento di personalizzazione di Office è controllato da un computer separato, consentendo il funzionamento del sistema OCT a parte la configurazione sperimentale automatizzata. Infine, i pacchetti software includono librerie per sincronizzare il posizionamento del probe dello Strumento di personalizzazione di Office e l’acquisizione dell’analisi dello Strumento di personalizzazione di Office (ad esempio, per acquisire automaticamente i set di dati di imaging 3D in un modello a mosaico o in un insieme di posizioni definite). La definizione della posizione della sonda OCT in 3D consente di regolare in modo efficace il piano focale in base a insiemi di scansioni (regionali). In particolare, su superfici non uniformi, è possibile specificare piani focali diversi (ad esempio, posizioni diverse nella direzione z) per ogni analisi dello Strumento di personalizzazione di Office.

È stato sviluppato un set di pacchetti softwareper elaborare le scansioni grezze dello Strumento di personalizzazione di Office (Tabella 1). Navigazione del dispositivo di posizionamento, l’acquisizione della scansione dello Strumento di personalizzazione di Office e l’elaborazione del set di dati vengono eseguite con notebook Jupyter con codifica Python, che consentono una notevole flessibilità nello sviluppo e nell’ottimizzazione del software. Due esempi lavorati e annotati di tali notebook (rispettivamente per l’acquisizione e l’elaborazione delle immagini) sono disponibili da https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git Essi sono da intendersi come punti di partenza per la personalizzazione del metodo. Un notebook Jupyter è un’applicazione basata su browser web che contiene celle con codice Python con annotato. Ogni passaggio è contenuto in una cella del blocco appunti, che può essere eseguita separatamente. A causa della diversa lunghezza del percorso della luce attraverso l’obiettivo di scansione (aberrazione sferica)¹⁵, le scansioni grezze dello Strumento di personalizzazione di Office appaiono distorte (Figura 2A). Abbiamo sviluppato un algoritmo per correggere automaticamente questa distorsione nelle scansioni dello Strumento di personalizzazione di Office acquisite (contenute in ImageProcessing.ipynb, Supplementary File 1). Inoltre, la morfologia dei biofilm può essere visualizzata come una mappa di elevazione 2D, come è stato precedentemente utilizzato nei sistemi di membrana¹⁶, e illustriamo come le mappe di elevazione ottenute da scansioni prese in una matrice di afiltura possono essere cucite.

Infine, la funzionalità dell’installazione di laboratorio descritta viene illustrata utilizzando un esperimento a flume in cui il biofilm del flusso fototrofico è esposto a un gradiente di velocità del flusso.