En strategi för att identifiera substanser som påverkar cell tillväxt och överlevnad i odlade däggdjursceller vid låg till måttlig genomströmning
Summary
Det är ofta nödvändigt att bedöma den potentiella cytotoxiciteten hos en uppsättning av föreningar på odlade celler. Här beskriver vi en strategi för att tillförlitligt skärm för giftiga föreningar i en 96-väl format.
Abstract
Cytotoxicitet är en kritisk parameter som måste kvantifieras när man studerar läkemedel som kan ha terapeutiska fördelar. På grund av detta, många Drug screening analyser utnyttja cytotoxicitet som en av de kritiska egenskaper som ska profileras för enskilda föreningar. Celler i kulturen är en användbar modell för att bedöma cytotoxicitet innan du fortsätter att följa upp lovande blyföreningar i mer kostsamma och arbetsintensiva djurmodeller. Vi beskriver en strategi för att identifiera föreningar som påverkar celltillväxt i en tdTomato uttrycker mänskliga neurala stamceller (NSC) linje. Strategin använder två kompletterande analyser för att bedöma cell nummer. En analys fungerar via minskningen av 3-(4,5-dimetyltizol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) till formazan som en proxy för cell nummer och den andra direkt räknar tdTomato uttrycker NSCs. De två analyserna kan utföras samtidigt i ett enda experiment och är inte arbetsintensiva, snabba och billiga. Den strategi som beskrivs i denna demonstration testade 57 föreningar i en förberedande primär skärm för toxicitet i en 96-bra plåtformat. Tre av träffarna karakteriserades ytterligare i en sex-punkts dos svar med samma assay set-up som den primära skärmen. Förutom att ge utmärkt bekräftelse för toxicitet, jämförelse av resultaten från de två analyserna kan vara effektiva i att identifiera föreningar som påverkar andra aspekter av celltillväxt.
Introduction
En av de viktigaste egenskaperna som måste bestämmas för en kemisk förening som har terapeutisk potential är dess toxicitet för djurceller. Denna egenskap kommer att avgöra om ett läkemedel är en bra kandidat för mer omfattande studie. I de flesta fall, föreningar med minimal toxicitet söks men det finns situationer där en förening med kapacitet att döda specifika celltyper är av intresse, e.g., anti-tumorigenic läkemedel. Även om hela djur är de bästa modellsystem för att bestämma systemisk toxicitet, är kostnaden och arbetskraft som är oöverkomliga när mer än ett fåtal föreningar måste testas. Som sådan däggdjurs-cellkultur används allmänt som det effektivaste alternativet1,2. Små till medelstora genomströmning drog skärmar är en viktig modalitet genom vilken toxicitet kan bedömas i cellkulturen. Dessa skärmar kan användas för att förhöra kommenterade bibliotek som riktar sig till enskilda signaleringsvägar. Det allmänna formatet på en sådan skärm är att initialt testa alla föreningar i biblioteket vid en engångsdos (vanligtvis 10 μM) i en undersökande primär toxicitet skärm, och sedan utföra en djupgående sekundär dos svar skärm för att fullt ut karakterisera toxiciteten profil för träffar från den primära skärmen. Metoderna för att genomföra denna strategi kommer att beskrivas här och ge ett snabbt, effektivt och billigt sätt att identifiera och karakterisera giftiga föreningar.
Flera metoder har utvecklats för att bedöma cytotoxicitet av små föreningar och nanomaterial i däggdjursceller3,4. Det bör noteras att vissa material kan interagera med analysen ger vilseledande resultat, och sådana interaktioner bör testas när karakterisera träffar från toxicitet skärmar4. Cytotoxicitetsanalyser inkluderar trypan Blue utslagning5, laktatdehydrogenas (LDH) Release assay6, Alamar Blue assay7, calcien acetoxymethyl Ester (am)8, och ATP-analysen9. Alla dessa analyser mäter olika aspekter av cellmetabolism som kan fungera som en proxy för cell nummer. Medan alla erbjuder fördelar, tetrazolium saltbaserade analyser såsom 3-(4,5-dimetyltizol-2-yl)-2, 5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), 2, 3-bis (2-metoxi-4-Nitro-5-sulfofeny)-2H-tetrazolium-5-karboxyanilidinnersalt (XTT)-1, och 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-nitrofenyl]-2H-5-tetrazolio)-1,3-bensen disulfonat (WST-1)10,11 ger god noggrannhet och enkel användning till låg kostnad. MTT, som kommer att användas i denna demonstration, reduceras till en olöslig formazan av en mitokondriell reduktas och hastigheten av denna omvandling korrelerar starkt med cell nummer. Denna analys har rutinmässigt utnyttjas i både en liten skala och för screening bibliotek med upp till 2 000 föreningar12. Direkt räkning av celler med en märkt markör erbjuder en annan metod för att bedöma mobiltelefonnumret, och till skillnad från MTT-analysen kan det ge ytterligare information om dynamiken i cellulära tillväxt. Flera allmänt tillgängliga algoritmer finns tillgängliga för att utföra automatiserade cell räknings analyser och det finns även egenutvecklade algoritmer som ingår i mjukvarupaket för bildläsare13,14. I denna metodbeskrivning, en mänsklig neurala stamcells (NSC) linje som har genetiskt redigerats till konstitutivt uttrycka tdTomato15 kommer att fungera som en test linje för att jämföra cellulära lönsamhet resultat mellan en MTT-analys och en automatiserad cellräkning analys på en skärm som bedömer toxiciteten hos 57 testsubstanser. Även om det primära målet med denna strategi var att identifiera och karakterisera giftiga föreningar, det har den ytterligare fördelen att potentiellt identifiera tillväxthämmande och tillväxtförbättrande föreningar och därmed ger en effektiv metod för att identifiera läkemedel som kan modulera cellulära tillväxt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det primära målet med denna artikel var att beskriva en strategi som effektivt och billigt kan identifiera föreningar som påverkar celltillväxt i en låg till måttlig-genomflöde screening. Två ortogonala tekniker utnyttjades för att bedöma cell nummer för att öka förtroendet för slutsatserna och erbjuda ytterligare insikter som inte skulle vara tillgängliga om bara en enda analys användes. En av de analyser som används en fluorescerande cell Imager att direkt räkna tdTomato-positiva celler och den andra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NINDS intramural forsknings program.
Materials
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
References
- National Research Council. . Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).
- Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
- Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
- Ciofani, G., Danti, S., D’Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
- Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).
- Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. 癌症研究. 47 (4), 936-942 (1987).
- Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
- Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
- Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).
