Uma estratégia para identificar compostos que afetam o crescimento celular e sobrevivência em células de mamíferos cultivadas em baixa a moderada taxa de transferência
Summary
Muitas vezes é necessário avaliar a citotoxicidade potencial de um conjunto de compostos em células cultivadas. Aqui, nós descrevemos uma estratégia para tela confiável para compostos tóxicos em um formato 96-well.
Abstract
A citotoxicidade é um parâmetro crítico que precisa ser quantificado ao estudar drogas que podem ter benefícios terapêuticos. Por causa disso, muitos ensaios de triagem de drogas utilizam a citotoxicidade como uma das características críticas a serem perfiladas para compostos individuais. As células na cultura são um modelo útil para avaliar a citotoxicidade antes de prosseguir para o acompanhamento de compostos promissores de chumbo em modelos animais mais dispendiosos e trabalhoso. Nós descrevemos uma estratégia para identificar os compostos que afetam o crescimento da pilha em um tdTomato que expressa a linha de pilhas de haste neural humanas (NSC). A estratégia utiliza dois ensaios complementares para avaliar o número de células. Um ensaio funciona através da redução de 3-(4, 5-dimetilthizol-2-yl)-2,5-difeniltetrazólio brometo (MTT) para formazan como um proxy para o número da célula e o outro conta diretamente o tdTomato expressando NSCs. Os dois ensaios podem ser realizados simultaneamente em um único experimento e não são trabalhoso, rápido e barato. A estratégia descrita nesta demonstração testou 57 compostos em uma tela preliminar exploratória para a toxicidade em um formato da placa de 96 poços. Três dos hits foram caracterizados mais em uma resposta da dose de seis pontos usando o mesmo ajuste-acima do ensaio que a tela preliminar. Além de proporcionar excelente corroboração para toxicidade, a comparação dos resultados dos dois ensaios pode ser efetiva na identificação de compostos que afetam outros aspectos do crescimento celular.
Introduction
Uma das características mais importantes que precisa ser determinada para um composto químico que tem potencial terapêutico é a sua toxicidade para as células animais. Esta característica determinará se uma droga é um bom candidato para um estudo mais extenso. Na maioria dos casos, os compostos com toxicidade mínima são procurados, mas há situações em que um composto com a capacidade de matar tipos de células específicas é de interesse, por exemplo, drogas antitumorigenic. Embora os animais inteiros sejam os melhores sistemas do modelo para determinar a toxicidade sistemática, o custo e o trabalho envolvidos são proibitivos quando mais do que alguns compostos precisam de ser testados. Como essa cultura de células de mamíferos é geralmente usada como a alternativa mais eficiente1,2. Telas de medicamentos de pequeno a médio débito são uma modalidade importante através da qual a toxicidade pode ser avaliada na cultura celular. Essas telas podem ser usadas para interrogar bibliotecas anotadas visando caminhos de sinalização individuais. O formato geral de tal tela é inicialmente testar todos os compostos na biblioteca em uma única dose (geralmente 10 μM) em uma tela de toxicidade primária exploratória e, em seguida, executar uma tela de resposta de dose secundária em profundidade para caracterizar plenamente a toxicidade Perfil de acertos da tela principal. Os métodos para implementar essa estratégia serão descritos aqui e fornecerão uma maneira rápida, eficiente e barata de identificar e caracterizar compostos tóxicos.
Foram desenvolvidos vários métodos para avaliar a citotoxicidade de pequenos compostos e nanomateriais em células de mamíferos3,4. Deve-se notar que certos materiais podem interagir com o ensaio fornecendo resultados enganosos, e tais interações devem ser testadas quando caracterizar hits de telas de toxicidade4. Os ensaios de citotoxicidade incluem a exclusão azul de Tripan5, o ensaio de libertação de lactato desidrogenase (LDH)6, o ensaio azul Alamar7, o éster acetoxymetil calcien (AM)8e o ensaio ATP9. Todos estes ensaios medem vários aspectos do metabolismo celular que pode servir como um proxy para o número de células. Enquanto todos oferecem benefícios, tetrazólio sal-base de ensaios como 3-(4, 5-dimetilthizol-2-yl)-2, brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT), 2,3-bis (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofeny)-2h-tetrazólio-5-carboxyanilide sal interno (xtt)-1 e 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-Nitrophenyl]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzeno disulfonato (WST-1)10,11fornecer boa precisão e facilidade de uso a baixo custo. O MTT, que será usado nesta demonstração, é reduzido a um formazan insolúvel por um redutase mitochondrial e a taxa desta conversão correlaciona fortemente com o número de pilha. Este ensaio tem sido rotineiramente utilizado em uma pequena escala e para bibliotecas de triagem com até 2.000 compostos12. A contagem direta de células por um marcador rotulado oferece outro método para avaliar o número de celular, e ao contrário do ensaio MTT pode fornecer informações adicionais sobre a dinâmica do crescimento celular. Vários algoritmos disponíveis publicamente estão disponíveis para realizar análises automatizadas de contagem de células e também há algoritmos proprietários que fazem parte dos pacotes de software paraleitores de imagens13,14. Nesta descrição do método, uma linha de células-tronco neurais humanas (NSC) que foi editada geneticamente para expressar constitutivamente o tdTomato15 servirá como uma linha de teste para comparar os resultados da viabilidade celular entre um ensaio de MTT e uma contagem de células automatizada ensaio em uma tela avaliando a toxicidade de 57 compostos de teste. Embora o objetivo principal desta estratégia fosse identificar e caracterizar compostos tóxicos, ele tem o benefício adicional de potencialmente identificar os compostos de crescimento inibitório e crescimento e, portanto, fornece um método eficaz para a identificação de drogas que pode modular o crescimento celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
O objetivo preliminar deste artigo era descrever uma estratégia que pudesse eficientemente e barata identificar os compostos que afetam o crescimento da pilha em uma baixa-à avaliação da moderado-taxa de transferência. Duas técnicas ortogonais foram utilizadas para avaliar o número de células para aumentar a confiança nas conclusões e oferecer insights adicionais que não estariam disponíveis se apenas um único ensaio fosse utilizado. Um dos ensaios usou um Imager da pilha fluorescente para contar diretamente…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo programa de pesquisa intramural da NINDS.
Materials
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
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