Une stratégie visant à identifier les composés qui affectent la croissance et la survie des cellules mammifères cultivées à un débit faible à modéré
Summary
Il est souvent nécessaire d’évaluer la cytotoxicité potentielle d’un ensemble de composés sur les cellules cultivées. Ici, nous décrivons une stratégie pour dépister de façon fiable les composés toxiques dans un format de 96 puits.
Abstract
La cytotoxicité est un paramètre critique qui doit être quantifié lors de l’étude des médicaments qui peuvent avoir des avantages thérapeutiques. Pour cette raison, de nombreux tests de dépistage de médicaments utilisent la cytotoxicité comme l’une des caractéristiques critiques à profiler pour les composés individuels. Les cellules en culture sont un modèle utile pour évaluer la cytotoxicité avant de procéder à un suivi des composés de plomb prometteurs dans des modèles animaux plus coûteux et à forte intensité de main-d’œuvre. Nous décrivons une stratégie pour identifier les composés qui affectent la croissance cellulaire dans une ligne de cellules souches neurales humaines (NSC) de tdTomato exprimant. La stratégie utilise deux essais complémentaires pour évaluer le nombre de cellules. Un exemple fonctionne par la réduction de 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromure (MTT) à formazan comme un proxy pour le nombre de cellules et l’autre compte directement le tdTomato exprimant NSCs. Les deux essais peuvent être effectués simultanément dans une seule expérience et ne sont pas laborieux, rapide et peu coûteux. La stratégie décrite dans cette démonstration a testé 57 composés dans un écran primaire exploratoire pour la toxicité dans un format de plaque de 96 puits. Trois des coups ont été caractérisés plus loin dans une réponse de dose de six points utilisant la même configuration de bout-de-vente que l’écran primaire. En plus de fournir une excellente corroboration pour la toxicité, la comparaison des résultats des deux essais peut être efficace pour identifier les composés affectant d’autres aspects de la croissance cellulaire.
Introduction
Une des caractéristiques les plus importantes qui doit être déterminée pour un composé chimique qui a un potentiel thérapeutique est sa toxicité pour les cellules animales. Cette caractéristique déterminera si un médicament est un bon candidat pour une étude plus approfondie. Dans la plupart des cas, des composés avec une toxicité minimale sont recherchés, mais il ya des situations dans lesquelles un composé avec la capacité de tuer des types de cellules spécifiques est d’intérêt, par exemple, les médicaments anti-tumorigènes. Bien que les animaux entiers soient les meilleurs systèmes modèles pour déterminer la toxicité systémique, le coût et la main-d’œuvre impliqués sont prohibitifs lorsque plus de quelques composés doivent être testés. En tant que telle culture de cellules de mammifères est généralement utilisé comme l’alternative la plus efficace1,2. Les écrans de drogue de petit à moyen débit sont une modalité importante par laquelle la toxicité peut être évaluée dans la culture cellulaire. Ces écrans peuvent être utilisés pour interroger les bibliothèques annotées ciblant les voies de signalisation individuelles. Le format général d’un tel écran est d’abord de tester tous les composés de la bibliothèque à une seule dose (généralement 10 M) dans un écran de toxicité primaire exploratoire, puis d’effectuer un écran de réponse de dose secondaire en profondeur pour caractériser pleinement la toxicité profil des hits de l’écran principal. Les méthodes de mise en œuvre de cette stratégie seront décrites ici et fourniront un moyen rapide, efficace et peu coûteux d’identifier et de caractériser les composés toxiques.
Plusieurs méthodes ont été développées pour évaluer la cytotoxicité des petits composés et des nanomatériaux dans les cellules de mammifères3,4. Il convient de noter que certains matériaux peuvent interagir avec le test fournissant des résultats trompeurs, et de telles interactions doivent être testées lors de la caractérisation des coups des écrans de toxicité4. Cytotoxicity essais comprennent trypan exclusion bleue5, lactate dehydrogenase (LDH) test de libération6, Alamar bleu essai7, calcien acétooxymethyl ester (AM)8, et l’essai ATP9. Tous ces essais mesurent divers aspects du métabolisme cellulaire qui peuvent servir de proxy pour le nombre de cellules. Bien que tous offrent des avantages, tetrazolium sel à base d’essais tels que 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromure (MTT), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide sel intérieur (XTT)-1, et 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-nitrophenyl]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzene disulfonate (WST-1)10,11 fournissent une bonne précision et une bonne facilité d’utilisation à faible coût. MTT, qui sera utilisé dans cette démonstration, est réduit à un formazan insoluble par une réductase mitochondriale et le taux de cette conversion est fortement corrélé avec le nombre de cellules. Cet exemple a été couramment utilisé à petite échelle et pour le dépistage des bibliothèques avec jusqu’à 2.000 composés12. Le comptage direct des cellules par un marqueur étiqueté offre une autre méthode pour évaluer le nombre cellulaire, et contrairement à l’analyse MTT, il peut fournir des informations supplémentaires sur la dynamique de la croissance cellulaire. Plusieurs algorithmes accessibles au public sont disponibles pour effectuer des analyses automatisées du nombre de cellules et il existe également des algorithmes propriétaires qui font partie de progiciels pour les lecteurs d’imagerie13,14. Dans cette description de méthode, une lignée de cellules souches neurales humaines (NSC) qui a été génétiquement modifiée pour exprimer de façon constitutive tdTomato15 servira de ligne d’essai pour comparer les résultats de viabilité cellulaire entre un essai de MTT et un comptage automatisé de cellules dans un écran évaluant la toxicité de 57 composés d’essai. Bien que l’objectif principal de cette stratégie était d’identifier et de caractériser les composés toxiques, elle a l’avantage supplémentaire d’identifier potentiellement les composés inhibiteurs de la croissance et la croissance et fournit ainsi une méthode efficace pour identifier les médicaments. qui peut moduler la croissance cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’objectif principal de cet article était de décrire une stratégie qui pourrait identifier efficacement et peu coûteux les composés affectant la croissance cellulaire dans un criblage à faible et modéré-débit. Deux techniques orthogonales ont été utilisées pour évaluer le nombre de cellules afin d’accroître la confiance dans les conclusions et d’offrir des informations supplémentaires qui ne seraient pas disponibles si un seul résultat était utilisé. L’un des essais a utilisé un imageur de cellules flu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été appuyé par le NINDS Intramural Research Program.
Materials
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
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