Una strategia per identificare i composti che influenzano la crescita cellulare e la sopravvivenza nelle cellule di mammaliana coltivate a bassa-moderato throughput
Summary
Spesso è necessario valutare la potenziale citotossicità di un insieme di composti sulle cellule coltivate. Qui, descriviamo una strategia per lo screening affidabile dei composti tossici in un formato di 96 pozze.
Abstract
La citotossicità è un parametro critico che deve essere quantificato quando si studiano farmaci che possono avere benefici terapeutici. Per questo motivo, molti saggi di screening farmacologico utilizzano la citotossicità come una delle caratteristiche critiche da profilare per i singoli composti. Le cellule nella coltura sono un modello utile per valutare la citotossicità prima di procedere a seguire composti di piombo promettenti in modelli animali più costosi e ad alta intensità di lavoro. Descriviamo una strategia per identificare i composti che influenzano la crescita cellulare in una linea di tdTomato che esprime cellule staminali neurali umane (NSC). La strategia utilizza due saggi complementari per valutare il numero di cellulare. Un saggio funziona attraverso la riduzione di 3-(4,5-dimetilthizol-2-yl)-2-diphenyltetrazolium bromuro (MTT) a formazan come proxy per il numero di cellulare e l’altro conta direttamente il tdTomato che esprime NSC. I due saggi possono essere eseguiti contemporaneamente in un unico esperimento e non sono laboriosi, rapidi e poco costosi. La strategia descritta in questa dimostrazione ha testato 57 composti in uno schermo primario esplorativo per la tossicità in un formato di piastra di 96 pozze. Tre dei colpi sono stati ulteriormente caratterizzati in una risposta alla dose di sei punti utilizzando lo stesso set-up assay come lo schermo primario. Oltre a fornire un’eccellente corroborazione per la tossicità, il confronto dei risultati dei due saggi può essere efficace nell’identificare i composti che interessano altri aspetti della crescita cellulare.
Introduction
Una delle caratteristiche più importanti che deve essere determinata per un composto chimico che ha un potenziale terapeutico è la sua tossicità per le cellule animali. Questa caratteristica determinerà se un farmaco è un buon candidato per uno studio più ampio. Nella maggior parte dei casi, si cercano composti con tossicità minima, ma ci sono situazioni in cui un composto con la capacità di uccidere specifici tipi di cellule è di interesse, ad esempio, farmaci anti-tumigenici. Anche se gli animali interi sono i migliori sistemi modello per determinare la tossicità sistemica, il costo e la manodopera coinvolti sono proibitivi quando più di un paio di composti devono essere testati. Come tale coltura cellulare mammiferi è generalmente utilizzato come l’alternativa più efficiente1,2. Gli schermi farmacologici di medio-piccolo e medio throughput sono una modalità importante attraverso la quale la tossicità può essere valutata nella coltura cellulare. Queste schermate possono essere utilizzate per interrogare le librerie con notato che prendono di mira singoli percorsi di segnalazione. Il formato generale di tale schermo è quello di testare inizialmente tutti i composti della libreria ad una singola dose (generalmente 10 M) in uno schermo di tossicità primaria esplorativo, e quindi eseguire uno schermo di risposta alla dose secondaria approfondita per caratterizzare completamente la tossicità profilo degli hit dalla schermata principale. I metodi per implementare questa strategia saranno descritti qui e forniranno un modo rapido, efficiente ed economico per identificare e caratterizzare i composti tossici.
Sono stati sviluppati diversi metodi per valutare la citotossicità di piccoli composti e nanomateriali nelle cellule dei mammiferi3,4. Va notato che alcuni materiali possono interagire con il saggio fornendo risultati fuorvianti, e tali interazioni dovrebbero essere testate quando caratterizzano i colpi provenienti da schermi di tossicità4. I saggi di citotossicità includono l’esclusione blu trypan5, lattato dehydrogenase (LDH) rilasciare asdetto6, Alamar blu assay7, calcien acetoxymethyl ester (AM)8, e il test ATP9. Tutti questi saggi misurano vari aspetti del metabolismo cellulare che può servire come proxy per il numero di cellule. Mentre tutti offrono vantaggi, saggi a base di sale di tetrazolium come 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2-diphenyltetrazolium bromuro (MT ), 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide sale interno (XTT)-1, e 4-(3-[4- Iodophenyl]-2-[4-nitrophenyl]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzene disulfonato (WST-1)10,11 fornire una buona precisione e facilità d’uso a basso costo. L’MTT, che verrà utilizzato in questa dimostrazione, è ridotto a un formazan insolubile da una riduttrice mitocondriale e il tasso di questa conversione è fortemente correlato al numero di cellulare. Questo saggio è stato regolarmente utilizzato sia su piccola scala che per le librerie di screening con fino a 2.000 composti12. Il conteggio diretto delle cellule da parte di un marcatore etichettato offre un altro metodo per valutare il numero cellulare e, a differenza dell’analisi MTT, può fornire informazioni aggiuntive sulle dinamiche della crescita cellulare. Diversi algoritmi pubblicamente disponibili sono disponibili per eseguire analisi automatizzate del conteggio delle celle e ci sono anche algoritmi proprietari che fanno parte di pacchetti software per lettori di imaging13,14. In questa descrizione del metodo, una linea di cellule staminali neurali umane (NSC) che è stata geneticamente modificata per sovrattuazionalmente esprimere tdTomato15 servirà come una linea di prova per confrontare i risultati della vitalità cellulare tra un saggio MTT e un conteggio automatico delle cellule un’immagine in una schermata che valuta la tossicità di 57 composti di prova. Anche se l’obiettivo principale di questa strategia era quello di identificare e caratterizzare i composti tossici, ha il vantaggio aggiuntivo di identificare potenzialmente i composti inibitori della crescita e di miglioramento della crescita e quindi fornisce un metodo efficace per identificare i farmaci che può modulare la crescita cellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’obiettivo principale di questo articolo era descrivere una strategia in grado di identificare in modo efficiente e conveniente i composti che influenzano la crescita delle cellule in uno screening a bassa o moderata velocità effettiva. Sono state utilizzate due tecniche ortogonali per valutare il numero di cellule per aumentare la fiducia nelle conclusioni e offrire ulteriori approfondimenti che non sarebbero disponibili se fosse stato utilizzato un solo saggio. Uno dei saggi ha usato un imager cellulare fluorescente …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dal NINDS Intramural Research Program.
Materials
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
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