אסטרטגיה לזיהוי תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים והישרדות בתאי מיונקים מתורבתים בתפוקה נמוכה לבינונית
Summary
לעתים קרובות יש צורך להעריך את הרעילות הפוטנציאלית של מערכת תרכובות על תאים מתורבתים. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה למסך מהימן עבור תרכובות רעילות בפורמט 96-היטב.
Abstract
רעילות ציטוזה הוא פרמטר קריטי שצריך לכמת כאשר לימוד תרופות שעשויות להיות בעלי הטבות טיפוליות. בגלל זה, הרבה סמים הקרנת התרופה לנצל את הרעילות בתור אחד המאפיינים הקריטיים להיות פרופיל עבור תרכובות בודדות. תאים בתרבות הם מודל שימושי כדי להעריך את הרעילות לפני שתמשיך לעקוב אחר תרכובות עופרת מבטיח יקר יותר, עבודה אינטנסיבית בעלי חיים מודלים. אנו מתארים אסטרטגיה כדי לזהות תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים ב tdTomato ביטוי בתאי גזע האדם העצבי (המועצה לבטחון לאומי) קו. האסטרטגיה משתמשת בשני משלים משלימים להערכת מספר התא. שיטת עבודה אחת פועלת באמצעות הפחתה של 3-(4, 5-diמתילתיול-2-yl)-2, 5-diפנילטיזויום ברומיד (MTT) כדי formazan כמו פרוקסי עבור מספר התא והשני במישרין סופרת את tdTomato המבטאת NSCs. שתי הדרישות יכולות להתבצע בו זמנית בניסוי אחד ואינן העבודה האינטנסיבית, המהירה והזולה. האסטרטגיה המתוארת בהפגנה זו נבדקה 57 תרכובות במסך ראשי מנוסה לרעילות בפורמט 96-באר הצלחת. שלוש מהתצפיות הוגדרו עוד יותר בתגובה למינון של שש נקודות, תוך שימוש באותה מערכת הערכה כמסך הראשי. בנוסף למתן אימות מעולה עבור רעילות, השוואה של תוצאות שתי בחני עשוי להיות יעיל בזיהוי תרכובות המשפיעות על היבטים אחרים של צמיחת תאים.
Introduction
אחד המאפיינים החשובים ביותר שצריך להיקבע עבור תרכובת כימית כי יש פוטנציאל טיפולי הוא רעילות שלה לתאי בעלי חיים. מאפיין זה יקבע אם הסם הוא מועמד טוב למחקר מקיף יותר. ברוב המקרים, תרכובות עם רעילות מינימלית מבוקשים אך ישנם מצבים בהם מתחם בעל יכולת להרוג סוגי תאים ספציפיים הוא עניין, למשל, תרופות אנטי-מוריגניות. למרות בעלי חיים שלמים הם מערכות מודל הטובה ביותר כדי לקבוע רעילות מערכתית, העלות והעבודה מעורבים הוא מונע כאשר כמה תרכובות צריך להיבדק. כגון תרבות תא של היונקים משמש בדרך כלל כחלופה היעילה ביותר1,2. מסכי הסמים קטנים עד בינוניים הם מודאליות חשוב שדרכו רעילות ניתן להעריך בתרבות התא. מסכי אלה ניתן להשתמש כדי לחקור ספריות מסומן מיקוד מסלולים בודדים איתות. הפורמט הכללי של מסך כזה הוא בתחילה לבדוק את כל התרכובות בספרייה במינון אחד (בדרך כלל 10 μM) במסך רעילות העיקרי גישוש, ולאחר מכן לבצע מינון מעמיק התגובה במינון המסך כדי לאפיין במלואו את רעילות פרופיל של כניסות מהמסך הראשי. השיטות ליישום אסטרטגיה זו יתואר כאן ויספקו דרך מהירה, יעילה וזולה לזהות ולאפיין תרכובות רעילות.
פותחו מספר שיטות כדי להעריך את הרעילות של תרכובות קטנות וננו בתאי מיונקים3,4. יש לציין כי חומרים מסוימים יכולים לקיים אינטראקציה עם הספקות המספקים תוצאות מטעות, ואינטראקציות כאלה יש לבדוק כאשר מדובר במאפיינים של מסכי רעילות4. רעילות ציטודיטוקסין כוללת טריפן כחול5, לקטט דהידרוגנאז (ldh) שחרור התשובה6, alamar שיטת כחול7, מתיל אסתר (AM)8, ואת שיטת ATP9. כל אלה בחני למדוד היבטים שונים של מטבוליזם התא אשר יכול לשמש proxy עבור מספר התא. בעוד שכולם מציעים יתרונות, aszo, מלח מבוסס על מלחים כגון 3-(4, 5-diמתילthizol-2-yl)-2, 5-דיפנפניזויום ברומיד (MTT), 2, 3-bis (2-מתיונין-4-ניטרו-5-sulfopheny)-2H-טטרזויום-5-carboxyande מלח פנימי (XTT)-1, ו-4-(3-[4- שפתי-על-2-[4-ניטרוגליצרין)-2H-5-טטרזוליו-1, 3-בנזין דיסולולאט (WST-1)10, 11 לספק דיוק טוב וקלות השימוש בעלות נמוכה. MTT, אשר ישמשו בהפגנה זו, הוא הופחת לתוך בלתי מסיסים על ידי מיטוכונדריאלי ושיעור ההמרה הזאת באופן מאוד מתאים למספר התא. מקרה זה נוצל באופן שגרתי הן בקנה מידה קטן והן לסינון ספריות עם עד 2,000 תרכובות12. ספירה ישירה של תאים על-ידי סמן המסומן בתווית מציעה שיטה נוספת להערכת המספר הסלולרי, ובשונה מהזמינותו של MTT היא יכולה לספק מידע נוסף על הדינמיקה של צמיחת הסלולר. מספר אלגוריתמים זמינים לציבור זמינים לביצוע ניתוחים אוטומטיים של ספירת תאים וקיימים גם אלגוריתמים קנייניים המהווים חלק מחבילות תוכנה לקוראי תמונות13,14. בתיאור שיטה זה, קו גזע הגוף האנושי (למועצה לבטחון לאומי) שנערך באופן גנטי כדי להשוות את תוצאות הכדאיות התאית בין שיטת mtt וספירת תאים אוטומטיים הערכה במסך הערכת רעילות של 57 תרכובות מבחן. למרות שהמטרה העיקרית של האסטרטגיה הזאת הייתה לזהות ולאפיין תרכובות רעילות, יש לה יתרון נוסף של הפוטנציאל לזיהוי מעכבות צמיחה ושיפור תרכובות הצמיחה וכך מספקת שיטה יעילה לזיהוי סמים שיכולים לווסת את הצמיחה התאית.
Protocol
Representative Results
Discussion
המטרה העיקרית של מאמר זה הייתה לתאר אסטרטגיה שיכולה ביעילות ובזול לזהות תרכובות המשפיעות על צמיחת תאים בהקרנה נמוכה עד בינונית תפוקה. שתי טכניקות אורתוגונאליות נוצלו להערכת מספר התאים כדי להגביר את האמון במסקנות ולהציע תובנות נוספות שלא יהיו זמינות אם נעשה שימוש באחד בלבד. אחד הבחני אומ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית המחקר של NINDS.
Materials
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
References
- National Research Council. . Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).
- Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
- Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
- Ciofani, G., Danti, S., D’Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
- Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).
- Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. 癌症研究. 47 (4), 936-942 (1987).
- Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
- Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
- Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).
