استراتيجية لتحديد المركبات التي تؤثر على نمو الخلايا والبقاء على قيد الحياة في خلايا الثدييات المستزرعة في الإنتاجية المنخفضة إلى المتوسطة
Summary
غالباً ما يكون من الضروري تقييم السمية الخلوية المحتملة لمجموعة من المركبات على الخلايا المستزرعة. هنا، ونحن نصف استراتيجية لفحص موثوق للمركبات السامة في شكل 96 جيدا.
Abstract
السمية الخلوية هي معلمة حرجة تحتاج إلى تحديد كمية عند دراسة الأدوية التي قد تكون لها فوائد علاجية. وبسبب هذا، يستخدم العديد من الاختبارات فحص المخدرات السمية الخلوية باعتبارها واحدة من الخصائص الحرجة التي ينبغي تحديدها للمركبات الفردية. الخلايا في الثقافة هي نموذج مفيد لتقييم السمية الخلوية قبل الشروع في متابعة مركبات الرصاص الواعدة في نماذج حيوانية أكثر تكلفة وكثيفة العمالة. نحن نصف استراتيجية لتحديد المركبات التي تؤثر على نمو الخلايا في tdTomato التعبير عن الخلايا الجذعية العصبية البشرية (NSC) خط. وتستخدم الاستراتيجية اثنين من الاختبارات التكميلية لتقييم رقم الخلية. يعمل اختبار واحد عن طريق تخفيض 3-(4,5-ثنائي ميثيل ثيزول-2-yl)-2,5-ثنائي الفينيل بروميد التترازوليوم (MTT) لتشكلكوكالة كوكيل لرقم الخلية والآخر يعد مباشرة tdTomato التعبير عن NSCs. يمكن إجراء الفحصين في وقت واحد في تجربة واحدة وليست كثيفة العمالة وسريعة وغير مكلفة. وقد اختبرت الاستراتيجية الموصوفة في هذه المظاهرة 57 مركباً في شاشة أولية استكشافية للسمية في شكل لوحة من 96 بئراً. وقد تم وصف ثلاثة من الضربات أكثر في استجابة جرعة من ست نقاط باستخدام نفس الإعداد اختبار الشاشة الأولية. وبالإضافة إلى تقديم دعم ممتاز للسمية، فإن مقارنة النتائج من الاختبارين قد تكون فعالة في تحديد المركبات التي تؤثر على جوانب أخرى من نمو الخلايا.
Introduction
واحدة من أهم الخصائص التي تحتاج إلى تحديد لمجمع كيميائي له إمكانات علاجية هو سميته للخلايا الحيوانية. هذه الخاصية ستحدد ما إذا كان الدواء هو مرشح جيد لدراسة أكثر شمولا. في معظم الحالات، يتم البحث عن مركبات مع الحد الأدنى من السمية ولكن هناك حالات فيها مركب مع القدرة على قتل أنواع محددة من الخلايا هو موضع اهتمام، على سبيل المثال، الأدوية المضادة للورم. على الرغم من أن الحيوانات كلها هي أفضل أنظمة نموذجية لتحديد السمية النظامية، فإن التكلفة والعمالة التي ينطوي عليها الأمر باهظة عندما تحتاج إلى اختبار أكثر من عدد قليل من المركبات. كما أن مثل هذه الثقافة الخلية الثدييات يستخدم عموما كبديل الأكثر كفاءة1،2. وشاشات المخدرات الصغيرة والمتوسطة الإنتاجية هي طريقة هامة يمكن من خلالها تقييم السمية في زراعة الخلايا. يمكن استخدام هذه الشاشات لاستجواب المكتبات المشروحة التي تستهدف مسارات الإشارات الفردية. الشكل العام لمثل هذه الشاشة هو اختبار في البداية جميع المركبات في المكتبة بجرعة واحدة (عموما 10 درجة مئوية) في شاشة سمية أولية استكشافية، ومن ثم إجراء شاشة استجابة جرعة ثانوية متعمقة لتوصيف السمية بشكل كامل ملف تعريف الزيارات من الشاشة الأساسية. وسيجري هنا وصف أساليب تنفيذ هذه الاستراتيجية وتوفير طريقة سريعة وفعالة وغير مكلفة لتحديد المركبات السمية وتوصيفها.
وقد وضعت أساليب متعددة لتقييم السمية الخلوية للمركبات الصغيرة والمواد النانوية في خلايا الثدييات3،4. وتجدر الإشارة إلى أن بعض المواد يمكن أن تتفاعل مع الفحص الذي يوفر نتائج مضللة، وينبغي اختبار هذه التفاعلات عند وصف الضربات من شاشات السمية4. وتشمل اختبار السمية الخلوية تريبان استبعاد الأزرق5، لاكتات dehydrogenase (LDH) اختبار الإصدار6، ألامار الأزرق اختبار7، استر الأسيتوإكسيميثيل (AM)8، وATP اختبار9. كل هذه الاختبارات قياس جوانب مختلفة من استقلاب الخلايا التي يمكن أن تكون بمثابة وكيل لرقم الخلية. في حين أن جميع الفوائد تقدم، والاختبارات المستندة إلى ملح تيترازوليوم مثل 3-(4,5-dimethylthizol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium بروميد (MTT)، 2،3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfopheny)-2H-tetrazolium-5-carboxyanilide الملح الداخلي (XTT)-1، و4-(3-4- يودوفينيل]-2-[4-نيتروفينل]-2H-5-tetrazolio)-1,3-benzene disulfonate (WST-1)10,11 توفر دقة جيدة وسهولة الاستخدام بتكلفة منخفضة. يتم تقليل MTT، والتي سيتم استخدامها في هذه المظاهرة، إلى شكل غير قابل للذوبان عن طريق اختزال الميتوكوندريا ويرتبط معدل هذا التحويل بقوة مع رقم الخلية. وقد استخدم هذا الفحص بشكل روتيني على نطاق صغير وللمكتبات التي تعرض ما يصل إلى 000 2 مركب12. يوفر العد المباشر للخلايا بواسطة علامة مسماة طريقة أخرى لتقييم رقم الخلايا الخلوية، وعلى عكس فحص MTT يمكن أن يوفر معلومات إضافية حول ديناميات النمو الخلوي. تتوفر العديد من الخوارزميات المتاحة للجمهور لإجراء تحليلات حساب الخلايا الآلي وهناك أيضا خوارزميات الملكية التي هي جزء من حزم البرمجيات لقراء التصوير13،14. في هذا الوصف الأسلوب، فإن خط الخلايا الجذعية العصبية البشرية (NSC) التي تم تحريرها وراثيا للتعبير عن المكونة tdTomato15 بمثابة خط اختبار لمقارنة نتائج الصلاحية الخلوية بين اختبار MTT وحساب الخلايا الآلي الفحص في شاشة تقييم سمية 57 مركبات الاختبار. على الرغم من أن الهدف الرئيسي لهذه الاستراتيجية كان تحديد وتوصيف المركبات السامة، إلا أن لها فائدة إضافية تتمثل في احتمال تحديد مركبات النمو المثبطة وتعزيز النمو، وبالتالي توفر طريقة فعالة لتحديد الأدوية التي يمكن أن تعدل النمو الخلوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
كان الهدف الرئيسي من هذه المقالة هو وصف استراتيجية يمكن أن تحدد بكفاءة وبتكلفة غير مكلفة المركبات التي تؤثر على نمو الخلايا في فحص الإنتاجية المنخفضة إلى المتوسطة. واستُخدمت تقنيتان متعامدة لتقييم رقم الخلية لزيادة الثقة في الاستنتاجات وتقديم رؤى إضافية لن تكون متاحة إذا ما استُخدم سوى ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل برنامج NINDS للبحوث داخل الجدارية.
Materials
| B-27 (50X) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Neural stem cell medium component. |
| BenchTop pipettor | Sorenson Bioscience | 73990 | Provides ability to pipette compound library into a 96-well plate in one shot. |
| BioLite 96 well multidish | Thermo Scientific | 130188 | Any 96 well cell culture plate will work. We use these in our work. |
| Cell culture microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Visual inspection of cells to ensure proper density. |
| Cytation 5/ Imaging reader | BioTek | CYT3MFV | Used for cell imaging and absorbance readings. |
| DMSO | Fisher Scientific | 610420010 | Solvent for compounds used in screen. Dissolves MTT precipitates to facilitate absorbance measurements. |
| FGF-basic | Peprotech | 100-18B | Neural stem cell medium component. |
| GelTrex | ThermoFisher Scientific | A1413202 | Neural stem cell basement membrane matrix. Allows cells to attach to cell culture plates. |
| Gen5 3.04 | BioTek | Analysis software to determine cell counts for tdTomato expressing cells. | |
| Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | Neural stem cell medium component. |
| Microtest U-Bottom | Becton Dickinson | 3077 | Storage of compound libraries. |
| MTT | ThermoFisher Scientific | M6494 | Active assay reagent to determine cellular viability. |
| Multichannel pippette | Rainin | E8-1200 | Column-by-column addition of cell culture medium, MTT, or DMSO. |
| Neurobasal medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Neural stem cell base medium. |
| RFP filter cube | BioTek | 1225103 | Filter in Cytation 5 used to image tdTomato expressing cells. |
| TrypLE | ThermoFisher Scientific | 12605036 | Cell dissociation reagent. |
References
- National Research Council. . Toxicity Testing in the 21st century: A Vision and a Strategy. , (2007).
- Llorens, J., Li, A. A., Ceccatelli, S., Sunol, C. Strategies and tools for preventing neurotoxicity: to Test, to predict, and how to do it. Neurotoxicology. 33 (4), 796-804 (2012).
- Adan, A., Kiraz, Y., Baran, Y. Cell proliferation and cytotoxicity assays. Current Pharmaceutical Biotechnology. 17 (14), 1213-1221 (2016).
- Ciofani, G., Danti, S., D’Alessandro, D., Moscato, S., Menciassi, A. Assessing cytotoxicity of boron nitride nanotubes: interference with the MTT assay. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (2), 405-411 (2010).
- Tennant, J. R. Evaluation of the trypan blue technique for determination of cell viability. Transplantation. 2 (6), 685-694 (1964).
- Korzeniewski, C., Callewaert, D. M. An enzyme-release assay for natural cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 64 (3), 313-320 (1983).
- Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. A new rapid and simple nonradioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay. Journal of Immunological Methods. 170 (2), 211-224 (1994).
- Neri, S., Mariani, E., Meneghetti, A., Cattini, L., Facchini, A. Calcein-acetyoxymethyl cytotoxicity assay: Standardization of a method allowing additional analyses on recovered effector cells and supernatants. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1131-1135 (2001).
- Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. Journal of Immunological Methods. 160 (1), 81-88 (1993).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into their cellular reduction. Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).
- Malik, N., et al. Compounds with species and cell type specific toxicity identified in a 2000 compound drug screen of neural stem cells and rat mixed cortical neurons. Neurotoxicology. 45, 192-200 (2014).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Cerbini, T., et al. Transcription activator-like effector nuclease (TALEN)-mediated CLYBL targeting enables enhanced transgene expression and one-step generation of dual reporter human induced pluriopotent stem cell (iPSC) and neural stem cell (NSC) lines. PLoS One. 10 (1), 0116032 (2015).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Qie, S., et al. Glutamine depletion and glucose depletion trigger growth inhibition via distinctive gene expression reprogramming. Cell Cycle. 11 (19), 3679-3690 (2012).
- Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8 (1), 3029 (2018).
- Carmichael, J., DeGraff, W. G., Gazdar, A. F., Minna, J. D., Mitchell, J. B. Evaluation of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. 癌症研究. 47 (4), 936-942 (1987).
- Romijn, J. C., Verkoelen, C. F., Schroeder, F. H. Application of the MTT assay to human prostate cancer cell lines in vitro: establishment of test conditions and assessment of hormone-stimulated growth and drug-induced cytostatic and cytotoxic effects. Prostate. 12 (1), 99-110 (1988).
- Jo, H. Y., et al. The unreliability of MTT assay in the cytotoxic test of primary cultured glioblastoma cells. Experimental Neurobiology. 24 (3), 235-245 (2015).
- Kalinina, M. A., Skvortsov, D. A., Rubtsova, M. P., Komarova, E. S., Dontsova, O. A. Cytotoxicity test based on human cells labeled with fluorescent proteins: photography, and scanning for high-throughput assay. Molecular Imaging and Biology. 20 (3), 368-377 (2018).
