クライオ走査型電子顕微鏡で可視化された木質植物のキシレム水分布

水資源(沈殿、土壌水分含有量)の利用可能性は、土壌から水を吸収し、光合成生産のために葉に輸送する必要があるため、植物種の死亡率と地理的分布を厳密に決定します。植物は、変動する水供給の下で水輸送システムを維持する必要があります。特に、木質植物は、場合によっては、地上100m以上のクラウンを保持する必要があるため、蒸散流れに沿って導管に高い張力を発生させます。このような高い負圧下で水柱を維持するために、キシレム導管は、硬直および疎水性細胞壁1を有する管状細胞の連続体からなる。各種におけるキシレム導管のキシレム機能障害に対する脆弱性は、変動する水^供給2の下での種生存の良好な決定要因である。また、キシレム導管の水位を調ることは、生物学的または生物学的ストレスを受けた個々の樹木の健康状態を評価するために重要である。樹液の流れまたは水の電位を測定することは、キシレム導管の統合された油圧機能による木質植物の水の状態の推定を提供できる。さらに、キシレム細胞における水の分布を可視化することで、キシレム油圧システムの個々の成分の状態を明らかにすることができる。

キシレム導管の水位を可視化するためのいくつかの技術が存在^する3.木質組織の水経路を観察するための古典的で有用な方法は、切断された枝の端を染料に浸すことによって、または立っている木の茎4に染料を注入することによって、水柱を染色することを含む。柔らかいX線写真はまたxylem5、6の水分の差動X線吸収強度によるスライスされた木ディスクの水配分の視覚化を可能^にする。しかし、これらの方法は、水の動きの軌跡を提供するか、水のマクロ的な分布を示すだけです。近年、マイクロフォーカスX線コンピュータ断層撮影(μCT)7、8、9、10、磁気共鳴画像(MRI)などの非破壊観測技術、¹²は、無傷の苗木内のキシレム導管中の水の観察を可能にするために大幅に改善された。これらの非破壊法は、人工切断効果なしにキシレムの水位を観察できるという大きな利点があり、シーケンシャルイメージングまたは造影^剤10の導入により水流のダイナミクスを追跡することができます。しかし、細胞レベルの水分含有量を識別できる画像を得るためには、植物イメージング用にカスタマイズされたMRIやシンクロトロン系μCTの特殊な施設を使用する必要があります。また、シンクロトロンベースのμCTシステムは、光顕微鏡7、8、9に匹敵する高い空間分解能で微細な画像を得ることを可能にしたが、高エネルギーX線13、14の放射線。クライオユニット(cryo-SEM)を設置した走査型電子顕微鏡(cryo-SEM)を採用することは、キシレム中の水を細胞レベルで正確に見つけ出す非常に有用な方法ですが、観察のためにサンプルを破壊的に収穫する必要があります。キシレム導管中の水を固定するために、茎の一部(すなわち、小枝、枝または茎)は、液体窒素(LN2)によってその中で凍結される。クライオSEMによるトリミングされた凍結標本の表面の観測は、キシレム導管中の水を氷として識別できるキシレム構造の高度に拡大された画像を提供します。この方法の重要な制限は、同じ試料内の水の移動性の逐次観察が不可能であるということです。しかし、フィールドに生息する樹木を順次観察するためのμCTまたはMRIの適用は、これらの器具が持ち運びにくいため、非常に困難です。対照的に、cryo-SEMは、フィールド実験で大きな木にこの技術を使用して、細胞レベルだけでなく、より細かい構造レベルで水内容を明確に可視化する可能性を秘めています(例えば、血管間^ピット15の水、水中)細胞間^空間16、または水柱17中の気泡。

クライオSEMによってキシレム水を観察する多くの研究は、5、12、18、19、20、21、23で報告されている。 内海ら(1996年)は、当初、LN2をステム21にセットした容器に充填することにより、生きている体幹の凍結固定により、その中でキシレムを観察するためのプロトコルを確立した。試料の温度は、キシレム導管内の氷を溶かすことを避けるために、サンプル収集中およびクライオSEM調製中に-20°C以下に維持した。この方法は、変化する水体制11、12、24、25、26の下で水の分布を明らかにするために、キシレム中の水を観察するために使用されてきた。 ^27,28, 水配分の季節変動^21,29,30, 凍結融解サイクルの効果¹⁷,^{31, 32、}湿った木の水の分布5、樹木からハートウッドへの移行中の水配分の変化、カンビアル活動と容器の分化の季節的な時間経過33、特定の生物学的ストレスによって誘発されるキャビテーション^23,34.キャビテーションに対する油圧伝導性および導管の脆弱性も、cryo-SEM^35,36を使用して検証されています。エネルギー分散X線分光法(EDXまたはEDS)を搭載したCryo-SEMは、^水37を含む検体の表面上の元素分布を研究するために用いられてきた。

高い油圧張力下の導管を含む生きているトランクの凍結固定は時々導管38、39の内腔の壊れた氷の結晶として凍結SEMによって観察される人工キャビテーションを引き起こす。特に、より長く、より広い導管を有する広い放置種は、水中3、40の下で行われても、サンプル切断によって引き起こされるキャビテーションなどの緊張誘発性アーティファクトに対して脆弱である。キャビテーションアーティファクトは、透過木のサンプリング後(すなわち、日中のサンプリング)または厳しい干ばつ条件下で顕著になり、キャビテーション発生の過大評価に誤解を与える可能性^{があります}3,^{38, 39}.したがって、導管で働く張力は、実際のキャビテーション3、12、39を避けるために解放されなければならない。

試料室に設置されたナイフを用いた凍結破壊技術は、しばしば凍結SEM観察のために標本表面を露出させるために用いられる。しかし、木質植物組織の凍結破砕面、特に二次キシレムの横断部は、組織6の解剖学的特徴および水を明確に観察するには粗すぎる。標本をトリミングするためのクライオスタットの適用はサンプル表面20、23の急速で、高品質の調製を可能にする。この方法の全体的な目標は、サンプリングアーティファクトの発生することなく、その中の様々な種類のキシレム細胞における水分布の電子顕微鏡分解能を示す証拠を提供することである。キシレムのクライオ固定サンプルの高品質な電子顕微鏡写真を得るための試料表面のサンプリング、トリミング、洗浄に関しては、初めて採用して着実に改善された最新の手順をご紹介します。